hMASP2 DNA纳米脂质体对BCG感染小鼠肺组织T细胞亚群和AKT/pAKT蛋白表达的影响

高 琪，张国超，何 琦，董信芳，雒艳萍，车团结，马兴铭

（1兰州大学基础医学院，2甘肃省功能基因组与分子诊断重点实验室，甘肃兰州730000）

hMASP2 DNA纳米脂质体对BCG感染小鼠肺组织T细胞亚群和AKT/pAKT蛋白表达的影响

高 琪1，张国超1，何 琦1，董信芳1，雒艳萍1，车团结2，马兴铭1

（1兰州大学基础医学院，2甘肃省功能基因组与分子诊断重点实验室，甘肃兰州730000）

目的：构建hMASP2 DNA纳米脂质体复合物，探讨hMASP2 DNA纳米脂质体对BCG感染小鼠肺组织T细胞亚群和AKT/pAKT蛋白表达的影响.方法：构建pcDNA3.1⁃hMASP2重组表达质粒，以脂质体作为载体，制备质粒DNA纳米脂质体复合物并检测Zeta电位和粒径；经鼻滴入1×109CFU BCG 100 μL，建立结核分枝杆菌感染小鼠模型，实验分DNA纳米脂质体组（pcDNA3.1⁃hMASP2组）和对照组，在感染当天小鼠尾静脉分别注射pcDNA3.1⁃hMASP2 200 μL（25 μg DNA）和PBS 200 μL，每3天注射一次，连续治疗三周后处死小鼠；分离肺组织淋巴细胞，流式细胞仪检测T细胞亚群；肺组织免疫组化分析AKT、pAKT蛋白表达.结果：pcDNA3.1⁃hMASP2 DNA纳米脂质体复合物Zeta电位52.6 mV、平均粒径279.9 nm；与对照组相比，pcDNA3.1⁃hMASP2组小鼠肺组织CD4＋T细胞亚群百分比明显升高（P＜0.05）、CD4＋PD⁃1＋T细胞亚群百分比降低（P＜0.05）；pcDNA3.1⁃hMASP2组小鼠肺组织AKT和pAKT的阳性细胞百分比明显增高（P＜0.05）.结论：构建稳定的pcDNA3.1⁃hMASP2 DNA纳米脂质体复合物，pcDNA3.1⁃hMASP2纳米脂质体增加BCG感染小鼠的肺组织的CD4＋T细胞、促进肺组织pAKT蛋白的表达，降低肺组织的PD⁃1＋T细胞亚群，从而上调小鼠T细胞功能.

纳米脂质体；MASP2；结核病；PD⁃1；AKT

0 引言

结核病（tuberculosis，TB）现已成为备受大家关注的全球性健康问题.2015年，世界各地估计有1040万例新发活动性结核病，同年全球造成约140万人死亡［1］.结核病是严重危害人类健康的经呼吸道传播的慢性传染病，近年来，我国每年报告肺结核发病人数约100万，始终位居全国甲乙类传染病的前列；耐多药肺结核危害日益凸显，每年新发患者人数约12万，未来数年内可能出现以耐药菌为主的结核病流行态势［2］.现如今，在药物治疗的基础上，免疫学疗法为结核病的治疗提供了新方法和新思路，其中结核分枝杆菌疫苗和IL⁃12使用最多，DNA疫苗以Ag85B效果最好，它能够刺激肉芽肿组织淋巴细胞的应答，达到延长动物寿命的目的［3］.IL⁃12能够推进CTL细胞成熟、引诱Th1分化、刺激T细胞、释放IFN⁃γ，免疫治疗具有较大应用潜力.

补体系统被认为是在炎症过程中具有重要作用的先天免疫系统的重要组成部分.可以通过经典途径、替代途径或凝集素途径激活，产生具有广泛免疫功能的C3a和C5a，以及能够直接裂解靶细胞的末端补体装置膜攻击复合物［4］.甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2（mannan⁃binding lectin associated ser⁃ine proteases，MASP2）是启动补体凝集素途径的关键效应酶，其基因位于染色体1p36上，由12个外显子组成，长约20 kb［5－6］.甘露糖结合凝集素（mannan⁃binding lectin，MBL）识别结合病原体后，与之结合的MASP2被激活，引发补体系统的抗体非依赖性活化途径，裂解C4和C2并激活后续补体级联反应，从而诱导炎症反应，并破坏并清除病原体［5］，因此，凝集素途径效应酶MASP2在发挥抗细菌感染方面具有重要的作用.

本实验室曾对MASP2蛋白进行表达和纯化，但其性质不稳定，在30 min即可降解，当MASP2蛋白浓度＞3 μg/L时，在无MBL参与的情况下可发生自行激活，使得MASP2蛋白难以大量纯化［7］.在前期的研究中，以腺病毒为载体构建的rAd⁃hMASP2对小鼠结核性肉芽肿的治疗具有明显治疗效果［8－11］，但腺病毒载体存在靶向性差、免疫原性强、半衰期短等缺点，限制了其在治疗中的应用［12］.为此，我们构建MASP2 DNA纳米脂质体复合物，由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成的脂质体进入人体内，被网状内皮系统吞噬而激活机体自身免疫功能，脂质体容易浸染细胞，并能够改变药物的体内分布，使药物主要在肝、肺等组织器官中积蓄，提高药物治疗效率.因此，在本实验构建hMASP2重组质粒，以脂质体为载体，制备DNA纳米脂质体复合物，评价其对BCG感染小鼠肺组织T细胞亚群和AKT/pAKT蛋白表达的影响.

1 材料和方法

1.1 hMASP2DNA纳米脂质体制备hMASP2全基因质粒pYr⁃ads⁃1⁃hMASP2由本实验室构建，E.coli DH5α和E.coli BL⁃21为本实验室保存；真核表达载体pcDNA3.1购自苏州金唯智有限公司；hMASP2的上下游引物由华大基因科技有限公司合成.以本实验室pYr⁃ads⁃1⁃hMASP2为模板进行PCR扩增，获取hMASP2全基因，上游引物序列GGGGTACCGCCAC⁃CATGAGGCTGCTGACCCTCCT，下游引物序列GGAATTCTTAAAAATCACTAATTATGTTCTC，酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ，将构建好的重组质粒交由华大基因科技有限公司测序，结果显示序列匹配，表明重组质粒构建成功.参考文献方法［13］构建hMASP2 DNA纳米脂质体复合物：用实验室已经制备的脂质体，调整其及质粒DNA的浓度，将脂质体与DNA 3∶1混合，剩余量用5%葡萄糖补足，用加样枪反复吹打混匀，置于4℃冰箱中过夜，次日用于小鼠尾静脉注射.

1.2 hMASP2 DNA纳米脂质体表征hMASP2 DNA纳米脂质体用Malvern Zetasizer Nano⁃ZS（Malv⁃ern Instruments，Worcestershire，UK）仪器检测MASP2其Zeta电位和粒径大小，判断其稳定性和纳米脂质体大小.

1.3 小鼠BCG感染模型建立与干预SPF级6～8周龄雌性昆明种小鼠（兰州大学实验动物中心），温湿度适宜、干净清洁的条件下饲养.扩增培养牛型结核分枝杆菌减毒株BCG D1331菌株（兰州大学结核病研究中心惠赠），第0天小鼠经鼻滴入1×109CFU 100 μL，建立小鼠结核病模型并随机将小鼠分为hMASP2脂质体复合物组（pcDNA3.1⁃hMASP2组）和PBS对照组，每组四只.BCG感染当天分别给予尾静脉注射pcDNA3.1⁃hMASP2脂质体复合物和等体积PBS，注射体积为200 μL（25 μg DNA），每隔三天注射一次.在第21天处死小鼠，取左肺组织分离淋巴细胞，流式细胞仪分析CD4、CD8、PD⁃1淋巴细胞亚群，右肺组织免疫组化染色检测AKT和pAKT的表达情况，并计算其阳性细胞百分比.

1.4 肺淋巴细胞分离与流式细胞术参考文献方法［14］分离肺组织淋巴细胞，即用40%的Percoll（Pharmacia，America）分离小鼠肺组织的淋巴细胞，用D⁃Hanks液洗涤两次，弃去上清后用PBS洗涤，100 μLPBS重悬后细胞计数.调整细胞浓度，取2×106个淋巴细胞进行染色，其中PE⁃抗CD4单克隆抗体（0.625 μL），APC⁃抗CD8单克隆抗体（0.625 μL），FITC⁃抗PD⁃1单克隆抗体（0.8 μL）加入后（三株荧光抗体购自eBioscience公司），轻轻涡旋混匀，4℃避光孵育30 min，然后加入预冷的PBS 1 mL进行重悬洗涤，上机检测（BD FACSCalibur），结果由FlowJo 7.6.1统计分析.

1.5 肺组织免疫组织化学染色用常规SABC免疫组化法检测小鼠右肺组织中AKT、pAKT的表达水平，常规石蜡切片脱蜡，乙醇水化，柠檬酸钠修复，3%H2O2孵育10 min，加兔抗鼠一抗（1∶100）（抗AKT抗体购自Bioss公司，抗pAKT抗体购自bioswamp公司），4℃过夜孵育，加Maxvision二抗（1∶100）37℃孵育20 min，PBS冲洗2 min×3次，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片，显微镜下观察，自上向下随机取10个高倍视野（×400），用Image⁃Pro plus 6.0软件进行分析，以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性信号，计算阳性细胞百分比.

1.6 统计学处理采用SPSS18.0软件学进行数据分析，计算出各组的M±SD，同时采用单因素方差分析计算P值，组间分析采用t检验，当P＜0.05时认为差异有统计学意义.实验数据制图使用Graph Pad Prism软件.

2 结果

2.1 hMASP2 DNA纳米脂质体表征hMASP2 DNA纳米脂质体经Malvern Zetasizer Nano⁃ZS（Malv⁃ern Instruments，Worcestershire，UK）仪器检测，测得其平均Zeta电位为52.6 mV，平均粒径大小为279.9 nm（图1）.制备的hMASP2 DNA纳米脂质体复合物性质稳定（Zeta＞40 mV，粒径100～300 nm）［9］，可用于小鼠尾静脉注射.

图1 MASP2 DNA纳米脂质体Zeta电位和粒径峰值

2.2 肺组织T细胞亚群流式细胞仪检测小鼠肺组织T细胞数量、亚群及百分比结果见图2～4.两组小鼠肺组织T细胞数、CD8＋T细胞亚群和CD8＋PD⁃1＋T细胞亚群百分比无统计学差异（P＞0.05）（图2、3）.与对照组相比，pcDNA3.1⁃hMASP2组小鼠肺组织CD4＋T细胞百分比明显增多，差异具有统计学意义（P＝0.028）；pcDNA3.1⁃hMASP2组小鼠肺组织CD4＋PD⁃1＋T细胞百分比明显降低，差异具有统计学意义（P＝0.023）.表明hMASP2 DNA纳米脂质体能够促进小鼠肺组织淋巴细胞的浸润和募集，并抑制CD4＋T淋巴细胞膜表面抑制性分子PD⁃1的表达.

图2 两组小鼠肺组织淋巴细胞总数

图3 两组小鼠肺组织CD4＋、CD8＋、CD4＋PD⁃1＋、CD8＋PD⁃1＋T细胞亚群百分比

图4 两组小鼠肺组织淋巴细胞亚群流式细胞术检测代表图

2.3 肺组织免疫组化检测每个切片观察4个高倍镜视野，每高倍镜视野计数100个细胞，综合判断阳性细胞染比例和染色强度.小鼠肺组织免疫组化检测结果见图5、6.与对照组相比，pcDNA3.1⁃hMASP2组AKT和pAKT阳性细胞百分比明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）.对照组小鼠肺组织中有较少的棕黄色阳性细胞分布，而hMASP2 DNA纳米脂质体组小鼠肺组织中有较多、集中分布的棕黄色阳性细胞.hMASP2DNA纳米脂质体组小鼠肺组织AKT、pAKT的表达水平均显著增加，表明hMASP2 DNA纳米脂质体能够促进小鼠肺组织细胞AKT表达，并增加磷酸化的pAKT水平.

图5 小鼠肺组织中AKT和pAKT免疫组化结果（IHC×100）

图6 小鼠肺组织中AKT和pAKT阳性细胞百分比

3 讨论

程序性死亡因子（PD⁃1/CD279）是共刺激分子CD28家族中的受体，主要表达于T细胞表面，通过与其配体PDL⁃1/2结合，抑制淋巴细胞增殖和细胞因子产生［15］.PD⁃1/PD⁃L1对调节T细胞功能起着至关重要的作用.在慢性感染、肿瘤患者体内，T细胞高表达PD⁃1分子，被认为是T细胞耗竭的标志［16－17］.结核患者的免疫力受损与巨噬细胞和T细胞活化受损、IFN⁃γ的产生减少密切相关［18］，结核分枝杆菌特异性CD4＋T细胞在活动性肺结核中的作用比CD8＋T细胞更重要［19］，并且活动性肺结核CD4＋T细胞高表达PD⁃1分子［20］.故通过下调T细胞PD⁃1分子的表达，改善患者的T细胞功能，是治疗慢性感染的策略之一.在本实验中，pcDNA3.1⁃hMASP2治疗组CD4＋T细胞比例明显升高、CD4＋PD⁃1＋T细胞比例降低，表明hMASP2 DNA纳米脂质体能够促进小鼠肺组织CD4＋T细胞的浸润和募集，并抑制PD⁃1分子的表达，从而上调CD4＋T细胞功能.磷酸肌醇三磷酸激酶⁃丝氨酸⁃苏氨酸蛋白激酶（phosphatidylinsitol 3⁃OH kinase⁃RAC⁃alphaserine/threonine⁃protein kinase，PI3K⁃AKT）信号通路广泛存在于细胞中，是细胞内重要信号通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态发挥其作用［21］.AKT也称为蛋白激酶B，一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过丝氨酸473和苏氨酸308的磷酸化激活，在多种细胞过程中起重要作用［22］.AKT是PI3K/AKT通路的中心环节，可被PI3K激活成为具有磷酸激酶活性的pAKT（磷酸化AKT），pAKT可诱导干扰细胞凋亡功能的信号，并且可能通过激活哺乳动物的雷帕霉素靶标和阻滞靶细胞通过正常的细胞周期等来促进细胞存活，增殖和运动［23－24］.在本实验中，pcDNA3.1⁃hMASP2组棕黄色的阳性细胞分布更广泛，并且AKT和pAKT阳性细胞百分比明显增高，其在小鼠肺组织中显著表达.一方面hMASP2 DNA纳米脂质体抑制BCG感染诱导的肺组织细胞凋亡，有利于肺组织修复.另一方面，肺肉芽组组织中有大量浸润T细胞，hMASP2 DNA纳米脂质体通过影响AKT和pAKT表达，促进浸润T细胞增殖、活化，拮抗PD⁃1对T细胞的下调作用，可能是其下调PD⁃1分子的表达机制之一，继而增强T细胞抗感染的效应功能.总之，结核病的发生、发展、治疗及预后是一个复杂的多因素参与的过程，本实验主要通过检测PD⁃1和AKT水平来初步评价hMASP2 DNA纳米脂质体对小鼠结核性肉芽肿的影响.hMASP2 DNA纳米脂质体作用于小鼠后，T细胞PD⁃1表达水平降低，AKT和pAKT表达均增加，表明hMASP2 DNA纳米脂质体对BCG感染小鼠肺组织局部免疫具有上调作用.但hMASP在小鼠体内的表达、hMASP2 DNA纳米脂质体对PD⁃1和AKT水平的调控机制需要进一步研究.

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Effects of hMASP2 DNA nano-liposomes on T-lymphocytesubsetsandexpressionof AKT/pAKT protein in lung tissue of BCG-infected mice

GAO Qi1，ZHANG Guo-Chao1，HE Qi1，DONG Xin-Fang1，LUO Yan-Ping1，CHE Tuan-Jie2，MA Xing-Ming11Department of Immunology，School of Basic Medical Science，Lanzhou University，2Gansu Key Laboratory of Functional Genom⁃ics and Molecular Diagnosis，Lanzhou 730000，China

AIM：To evaluate the potential impacts of human MASP2（hMASP2）DNA nano liposomes on T⁃lymphocyte sub⁃sets and AKT/pAKT protein expression in lung tissue of BCG⁃in⁃fected mice through constructing the hMASP2 DNA nano⁃lipo⁃somes complex.METHODS：The pcDNA3.1⁃hMASP2 recombi⁃nant plasmids were constructed and then the hMASP2 DNA nano⁃liposomes complex were prepared with a carrier of liposome.The zeta potential and particle size of hMASP2 DNA nano⁃liposomes were detected.After infection with 100 μL of 1×109CFU BCG，mice were randomly divided into two groups and

the fol⁃lowing treatments：the mice of hMASP2 DNA nano⁃liposomes group were injected by tail vein with 200 μL（25 μg DNA）of DNA nano⁃liposomes and the mice of control group were received PBS（200 μL）by tail vein.All mice were injected every three days and treated for 3 weeks，then were killed.Lymphocytes were isolated from lung tissue and PD⁃1＋T cell subsets were detected by flow cytometry.The expression of AKT/pAKT protein was detected with immunohistochemical staining.RESULTS：The zeta potential of pcDNA3.1⁃hMASP2 DNA nano⁃liposome complex was 52.6 mV and the average particle size was 279.9 nm.Com⁃pared with the control group，the percentage of CD4＋T⁃lympho⁃cyte subsets in the lung tissue of mice treated with hMASP2 DNA nano⁃liposomes were significantly increased（P＜0.05）and the percentage of CD4＋PD⁃1＋T⁃lymphocyte subsets were significantly decreased（P＜0.05）.The percentage of AKT and pAKT positive cells in hMASP2 DNA nano⁃liposomes group were significantly increased（P＜0.05）.CONCLUSION：A stable pcDNA3.1⁃hMASP2 DNA nano⁃liposome complex is firstly constructed，which shows the positive efficacy in increasing the number of CD4＋T cells，reducing the number of PD⁃1＋T⁃lymphocyte sub⁃sets，and promoting the expression of pAKT of BCG⁃infected mice.These findings provide experimental evidence that hMASP2 DNA nano⁃liposomes display a potential role of up⁃regulating T⁃cell⁃mediated immunity in tuberculosis.

nano⁃liposomes；MASP2；tuberculosis；PD⁃1；AKT

R730.45

A

2017－07－21；接受日期：2017－08－03

兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金（lzujbky－2017－117）；兰州市科技计划项目（2016－3－107）

高 琪.硕士.E⁃mail：gaoqijy＠163.com

雒艳萍.副教授.马兴铭（共同通讯作者）.教授.E⁃mail：maxm＠lzu.edu.cn

2095⁃6894（2017）10⁃35⁃04