樱桃叶水煎液对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠的免疫增强作用

原 新，徐志立，梁晗业，穆阳阳，张明波 （辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

樱桃叶水煎液对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠的免疫增强作用

原 新，徐志立，梁晗业，穆阳阳，张明波 （辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

目的：探讨樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫增强作用.方法：腹腔注射环磷酰胺造成小鼠免疫低下模型，给药后观察小鼠血清中溶血素水平，炭粒廓清功能及迟发型变态反应.结果：免疫低下小鼠给予樱桃叶水煎液后，血清中溶血素水平明显升高，炭粒廓清能力及迟发型变态反应增强.结论：樱桃叶可增强免疫低下小鼠的免疫功能.

樱桃叶；免疫低下；炭粒廓清；溶血素水平

0 引言

樱桃（Cerasus pseudocerasus L.）为蔷薇科多年生木本植物，樱桃叶收录于《中华本草》，为蔷薇科植物樱桃的叶片，性温、味辛苦、无毒，可温胃、健脾、止血、解毒，用于治疗胃寒食积、腹泻、吐血、疮毒等［1］.樱桃在辽宁南部地区广泛种植，樱桃叶来源丰富，樱桃叶的开发与利用具有较好的市场价值与社会效益.但目前对樱桃叶的开发利用研究较少，除极少量用于枕头填充物外，多被作为动物饲料或废渣丢弃，造成资源浪费及环境污染［2］.为了给予樱桃叶的进一步开发提供科学依据，本研究考察樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫增强作用，现报道如下.

1 材料和方法

1.1 动物BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体质量18～22 g，购自大连医科大学实验动物中心，许可证号SCXK（辽）2013⁃0003.动物饲养条件：清洁级环境饲养，温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%，控制照明时间为14 h.适应两周后开始实验.

1.2 药品樱桃叶采自大连市旅顺口区，经中药鉴定教研室王添敏副教授鉴定为蔷薇科植物、品种为大红灯樱桃的叶片.注射用环磷酰胺（江苏盛迪医药有限公司，批号16101125）；丙酮（国药集团化学试剂公司，批号20110728）；2，4⁃二硝基氟苯（成都艾科达化学试剂有限公司，批号201411171）；碳酸钠（北京化工厂，批号20031218）；盐酸左旋咪唑片（山东仁和堂药业有限公司，批号140802）；注射用印度墨汁（北京诺博莱德科技有限公司），临用前以生理盐水稀释8倍.

1.3 仪器UV⁃5600紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；MA240D型电子分析天平（上海第二天平仪器厂）；TG⁃16W型台式离心机（长沙湘仪离心机有限公司）.

1.4 方法

1.4.1 樱桃叶水煎液的制备 樱桃叶粉碎后加8倍量蒸馏水浸泡5 h，加热煮沸后改文火加热20 min，稍冷后过滤，滤渣再加6倍量水同上法煎煮20 min，过滤后合并两次滤液，浓缩为40%樱桃叶水煎液.

1.4.2 环磷酰胺所致免疫抑制模型建造 在实验结束前7 d，除正常对照组小鼠注射等体积生理盐水外，各组小鼠腹腔注射环磷酰胺注射液80 mg/kg，连续3 d［3⁃4］.

1.4.3 分组及给药 各实验均取60只小鼠，随机分为6组.分别为正常对照组（n＝10），免疫功能低下模型对照组（n＝10），樱桃叶水煎液高（n＝10）、中（n＝10）、低剂量组（n＝10），左旋咪唑阳性对照组（n＝10）.樱桃叶水煎液高、中、低剂量组分别灌胃给予4 g/kg，2 g/kg，1 g/kg的樱桃叶水煎液；左旋咪唑组灌胃给予25 mg/kg；正常对照组及模型对照组灌胃等体积蒸馏水；1次/d，连续35 d.

1.4.4 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠炭粒廓清功能的影响 第35天末次给药后120 min，尾静脉注射印度墨水0.1 mL/10 g，分别在注射后的5 min和20 min各组小鼠眼眶取血25 μL，立刻溶于0.1%Na2CO32 mL溶液中，摇匀，600 nm比色，测定吸光度（OD值），解剖小鼠，取肝、脾，称重，计算廓清指数K值和校正廓清指数α值.廓清指数K＝（lgOD1－lgOD2）/（t2⁃t1），校正廓清指数α＝3K×体质量（g）/（肝重（g）＋脾重（g））［5⁃6］.

1.4.5 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠迟发性变态反应（delayed type hypersensitivity，DTH）的影响 给药后第29天，致敏各组小鼠（背部皮肤涂抹0.5%二硝基氟苯丙酮溶液50 μL），第34天激发（0.5%二硝基氟苯丙酮溶液50 μL涂抹于小鼠左耳两面）.第35天即激发后24 h，小鼠处死，剪下左右两耳，并用打孔器将每只小鼠的左右耳相同部位打下相同面积的耳片，分析天平称耳片重量，以左、右耳片重量差的毫克数作为鼠耳迟发性超敏反应强度.计算肿胀度（%）＝（左耳重量－右耳重量）/右耳重量×100%.取胸腺及脾脏，称重，计算胸腺指数、脾指数［7－8］.

1.4.6 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影响 在首次给药后第30天，各组小鼠腹腔注射5%绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC），每只0.2 mL，连续3 d，免疫后5 d（即给药后第35天）取血，离心，分离血清，将血清用生理盐水稀释300倍；取1 mL稀释后血清加入试管内，各试管分别加入5%SRBC 0.5 mL，10%补体1 mL，37℃下孵育30 min，移至冰浴终止反应；1500 r/min，离心5 min，取上清1 mL，加入3 mL都氏试剂，混匀，10 min后540 nm比色；取同实验用的5%SRBC 0.25 mL，加入4 mL都氏试剂，混匀，10 min后540 nm处比色，即SRBC半数溶血时吸光度值.半数溶血值HC50＝（样品吸光度值÷SRBC半数溶血时的吸光度值）×稀释倍数［9］.

1.5 统计学处理采用IBM SPSS 21.0软件对数据进行分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 免疫抑制小鼠模型的制备小鼠注射环磷酰胺后，与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠胸腺指数、脾指数明显降低，对二硝基氟苯所致DTH反应显著降低，炭粒廓清功能及溶血素水平明显降低，表明免疫抑制小鼠模型制备成功（表1、2、3）.

表1 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠炭粒廓清功能的影响（ ±s，n＝1 0）

表1 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠炭粒廓清功能的影响（ ±s，n＝1 0）

bP＜0.01 vs正常对照组；cP＜0.05，dP＜0.01 vs模型对照组.

组别剂量（mg/kg）OD值K值α值5 min20 min正常对照组——0.289±0.0370.161±0.0350.017±0.0084.434±0.955模型对照组——0.190±0.0520.139±0.0430.009±0.0063.143±0.432b樱桃叶水煎液高剂量组40000.285±0.0240.179±0.0250.014±0.0044.326±0.779d樱桃叶水煎液中剂量组20000.328±0.0600.193±0.0260.015±0.0063.919±0.711d樱桃叶水煎液低剂量组10000.302±0.0200.229±0.0320.008±0.0043.505±0.829左旋咪唑组250.323±0.0360.182±0.0320.017±0.0054.162±0.993c

表2 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠DTH的影响（±s，n＝10）

表2 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠DTH的影响（±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常对照组；cP＜0.05，dP＜0.01 vs模型对照组.

组别剂量（mg/kg）小鼠耳片重量（mg）反应强度（mg）肿胀度（%）左耳右耳正常对照组——6.46±1.083.61±0.622.85±0.6379.97±16.41模型对照组——4.57±0.813.75±0.710.82±0.34b22.31±9.63b樱桃叶水煎液高剂量组40006.49±1.233.73±0.802.76±0.65d75.46±17.61d樱桃叶水煎液中剂量组20005.16±0.653.55±0.561.61±0.36d46.24±13.37d樱桃叶水煎液低剂量组10005.03±1.133.69±0.771.34±0.38c35.96±4.60c左旋咪唑组255.87±0.973.65±0.512.22±0.58d60.81±12.43d

表3 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠溶血素水平及胸腺指数和脾指数的影响（ ±s，n＝10）

表3 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠溶血素水平及胸腺指数和脾指数的影响（ ±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常对照组；cP＜0.05，dP＜0.01 vs模型对照组.

组别剂量（mg/kg）半数溶血值HC50胸腺指数（mg/g）脾指数（mg/g）正常对照组——119.26±13.622.46±0.465.16±1.18模型对照组——62.92±7.09b1.28±0.44b3.11±0.54b樱桃叶水煎液高剂量组4000107.86±14.24d2.19±0.0.59d5.03±0.41c樱桃叶水煎液中剂量组200093.53±5.40d1.38±0.253.91±1.30樱桃叶水煎液低剂量组100076.80±8.15d1.05±0.203.36±0.42左旋咪唑组25105.45±9.49d1.67±0.64c4.22±1.18d

2.2 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠炭粒廓清功能的影响与正常组相比，环磷酰胺导致免疫低下模型组小鼠的炭粒廓清能力明显下降（P＜0.01）；而给予樱桃叶水煎液高、中剂量可明显提高免疫低下小鼠的炭粒廓清功能（P＜0.01，表1）.

2.3 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠DTH的影响与正常对照组相比，给予环磷酰胺后，模型组对于二硝基氟苯所致DTH反应显著降低（P＜0.01），而免疫抑制小鼠灌胃给予樱桃叶水煎液后，DTH反应强度明显增强（P＜0.05，P＜0.01，表2）.

2.4 樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠溶血素水平、胸腺指数及脾指数的影响与正常对照组比较，免疫低下小鼠半数溶血值明显降低（P＜0.01），樱桃叶可显著提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠的半数溶血值（P＜0.01）.小鼠灌胃给予不同剂量樱桃叶水煎液后，各组小鼠的胸腺指数与脾指数均有提高，并呈剂量依赖性，其中高剂量组与模型组比较具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，表3）.

3 讨论

樱桃种植范围广，樱桃叶来源丰富且价廉，对樱桃叶提取物及其组分的研究与开发有广阔的前景.樱桃具有抗衰老，抗自由基，抗氧化，抗炎，抗类风湿性、痛风性关节炎，抗前列腺增生等活性［10－13］.对于樱桃叶及其活性成分的药理作用，亦有学者进行了多方面研究，研究表明樱桃叶水煎液显示出明显的降压作用，效价强于樱桃叶中所含总黄酮苷［14］，樱桃叶中多糖可增强机体清除自由基活性，抑制大鼠肝自发性脂质过氧化［14］.樱桃叶中黄酮类亦有较强的体外抗氧化活性，抑制H2O2诱导的小鼠红细胞溶血［15］.但针对樱桃叶对于免疫抑制状态下的免疫调节作用研究较少.

机体免疫系统主要有三大功能：免疫防御、免疫监视和免疫自稳定，免疫抑制会导致机体防御、识别与排除外来抗原（病原微生物等）和自身抗原的能力下降，难以维持机体生理平衡，导致疾病产生.本研究采用经典的环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠模型，考察樱桃叶水煎液对免疫抑制小鼠免疫功能的促进作用.

脾脏和胸腺都是人体重要的免疫器官，胸腺对维持细胞免疫和调节免疫反应起重要的作用，脾脏是机体细胞免疫和体液免疫的中心［16］.机体免疫系统中，巨噬细胞是最先对抗原产生反应的免疫细胞之一，其吞噬功能反映机体的非特异性免疫功能［17］.DTH是检测T细胞功能的体内实验方法之一，通过测定受试物对机体DTH反应的影响，可反应机体的T细胞功能或受试物的作用.二硝基氟苯是一种半抗原，其进入机体后与体内蛋白结合为完全抗原，刺激T淋巴细胞增殖为致敏淋巴细胞，从而诱导细胞免疫反应（DTH反应）.经SRBC免疫后，小鼠的淋巴细胞产生抗SRBC抗体（溶血素），可通过测定在体外溶血反应中释放的血红蛋白表示免疫小鼠血清中溶血素含量，反映机体特异性体液免疫功能.

本研究结果表明，樱桃叶水煎液能显著提高小鼠炭粒廓清能力，提示樱桃叶可促进机体内皮网状系统对异物的廓清、吞噬，提高机体非特异性免疫；樱桃叶水煎液对环磷酰胺所致免疫低下小鼠的DTH反应具有明显刺激作用，表明其可显著增加免疫抑制状态小鼠的细胞免疫功能；樱桃叶能对抗环磷酰胺引起的脾、胸腺萎缩，对脾与胸腺具有保护作用.实验结果亦显示，樱桃叶可提高免疫抑制小鼠的半数溶血值，增加抗体水平，提高免疫抑制小鼠的体液免疫功能.

总之，樱桃叶对于环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的非特异性、特异性体液免疫及特异性细胞免疫功能均具有增强作用，可能对于临床免疫抑制性疾病具有良好的治疗效果.有关其促进免疫的活性仍需要进一步研究.

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The immunological enhancement of decoction of cherry leaf on immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide

YUAN Xin，XU Zhi-Li，LIANG Han-Ye，MU Yang-Yang，ZHANG Ming-Bo
College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China

AIM：To investigate the immunological enhancement of decoction of cherry leaf on immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide.METHODS：The carbon clearance function，delayed type hypersensitivity（DTH）activities and hemolysin lev⁃el were determined in immunosuppressed mice induced by cyclo⁃phosphamide after administrating with decoction of cherry leaf of different concentration.RESULTS：The carbon clearance func⁃tion，delayed type hypersensitivity（DTH）activities and hemoly⁃sin level were increased obviously in immunosuppressed mice after administrating with decoction of cherry leaf.CONCLUSION：The cherry leaf could improve the immune function of immunosup⁃pressed mice.

cherry leaf；immune suppression；carbon clear⁃ance；hemolysin level

R285.5

A

2017－05－13；接受日期：2017－06－01

2016年辽宁中医药大学大学生创新创业训练计划项目（201610162067）

原 新.本科.E⁃mail：2621194230＠qq.com

徐志立.博士，副教授，硕导.研究方向：中药药理学.E⁃mail：xu＿zhili＠126.com

2095⁃6894（2017）10⁃43⁃04