海洋创伤弧菌感染对宿主免疫系统的影响研究

付凯飞，刘剑飞，王欲晓，吴成林，钦可为，周丽君 （解放军海军总医院中心实验科，北京100048）

·论著·

海洋创伤弧菌感染对宿主免疫系统的影响研究

付凯飞，刘剑飞，王欲晓，吴成林，钦可为，周丽君 （解放军海军总医院中心实验科，北京100048）

目的：探讨重要海洋致病菌创伤弧菌对小鼠免疫器官及免疫组织的感染效应，为有效的感染诊治提供新思路.方法：以亚致死剂量的创伤弧菌感染BALB/c小鼠，采用病理显微镜技术观察小鼠脾脏及肠道淋巴组织病理学变化，应用流式细胞技术检测外周血及脾脏的淋巴细胞坏死/凋亡情况和淋巴细胞亚群分布变化，并在人工合成创伤弧菌溶血素蛋白基础上，采用细胞毒实验检测创伤弧菌主要毒力因子对淋巴细胞损伤情况.结果：创伤弧菌感染后，脾脏及肠道相关淋巴组织均有明显的结构改变，出血/充血明显，淋巴细胞可见碎裂、坏死；创伤弧菌感染后外周血及脾脏内的淋巴细胞损伤以凋亡尤为显著，同时淋巴细胞各亚群失去正常比例，CD4＋T细胞明显低于对照组，CD4＋/CD8＋T细胞比例也显著降低（P＜0.05）；体外CCK⁃8细胞毒活性实验也显示，一定浓度的创伤弧菌溶血素蛋白可显著降低淋巴细胞的存活率（P＜0.01）.结论：创伤弧菌感染对免疫组织细胞有明显的破坏作用，可能导致感染后期发生免疫抑制，进一步加重继发感染.

创伤弧菌；免疫组织；溶血素；淋巴细胞；流式检测

0 引言

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）是一种广泛分布在海洋中的致病弧菌，以致病毒力强、感染死亡率高著称.接触或食用被创伤弧菌感染的鱼、虾、贝类等海产品，或开放性伤口接触海水等均可引起创伤弧菌感染，导致急性胃肠炎、创口蜂窝织炎、坏死性筋膜炎，甚至脓毒血症等症状，偶还可致肺炎、自发性腹膜炎和脑膜炎［1－2］.世界范围内的创伤弧菌感染病例时有发生，最早的报道见于1970年，Roland发现创伤弧菌感染导致小腿坏疽和内毒素性休克［3］，此后国内外一些沿海城市相继有创伤弧菌感染的临床报告，国内病例多集中于浙江温州地区和台湾地区［4－5］.而且多数病例分析报告［6－7］表明，发生创伤弧菌感染性重症败血症患者大多是免疫力低下人群，如患有糖尿病、肝损伤、酒精性肝硬变等，感染后引发的败血症往往为多脏器累及，一旦发生败血症性休克，死亡率将达100%.目前已有大量针对创伤弧菌致病性及毒力的研究报道，常见的宿主感染效应及部分致病机制也得以阐明，但其对免疫系统是否存在特殊损伤效应目前国内外均鲜见报道.为此，我们在既往研究结果基础上，将创伤弧菌感染后免疫组织的病理学改变和免疫细胞变化相结合，在不同病变水平上评估其对免疫系统的损伤，并对目前公认的创伤弧菌致病元凶——溶血素（Vibrio vulnificus cytolysin，VVC）的淋巴毒活性进行检测，从免疫学角度进一步揭示其致病效应机制.

1 材料和方法

1.1 主要试剂RPMI⁃1640培养液购自美国Hy⁃clone公司；胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所；2216E海生菌培养肉汤，胸腺依赖淋巴细胞（thymusdependent lymphocytes，T淋巴细胞）、骨髓依赖淋巴细胞（bone marrow dependent lymphocyte，B淋巴细胞）和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）亚群检测试剂盒，以及细胞坏死/凋亡（Annexin⁃V/7⁃AAD）检测试剂盒均购自美国BD（Becton，Dick⁃inson and Company）公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司；细胞增殖活性检测试剂盒（cell count⁃ing kit⁃8，CCK⁃8）购自东仁化学科技公司.

1.2 菌株及细胞创伤弧菌（MCCC⁃1H00066）购于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，于2216E海生菌培养肉汤中37℃恒温培养；AHH⁃1细胞为本研究室保存，在1640培养液（含10%胎牛血清）中以37℃、50 mL/L CO2孵箱条件培养.

1.3 创伤弧菌溶血素蛋白根据GeneBank中公布的创伤弧菌VVC（GenBank＝NC＿005140.1）序列设计扩增目的基因引物［Pvvf1：5'⁃gcggatccatgaaaaaaat⁃gactctgttt⁃3'（BamH 1）、Pvvr2：5'⁃ccctcgaggagtttgacttgttg⁃taatgt⁃3'（Xho 1）］，委托上海生工进行基因的克隆与鉴定，并构建原核表达质粒，获得大肠杆菌中的高效表达并SDS⁃PAGE鉴定，将纯化VVC蛋白－70℃保存备用.

1.4 实验动物及感染模型制备雌性BALB/c小鼠（8周龄）购于解放军海军总医院动物中心.调整创伤弧菌悬液浓度为106CFU/mL，选取实验组小鼠于右下腹进行腹腔注射（1 mL/只），对照组腹腔注射等量灭菌的生理盐水.

1.5 病理学标本的制备及观察注射后12 h眼球取血，断椎法处死后取脾脏、并剪除小肠淋巴结，放于10%缓冲甲醛溶液固定2～3 d后，石蜡包埋制片，HE染色，光镜观察其组织病理变化.

1.6 流式检测样本制备

1.6.1 外周血样本 将所采小鼠眼球抗凝血稀释后，加于分离液之液面上，以400 g离心20 min，小心吸取淋巴细胞分离层，用PBS重复离心洗涤3次，并将离心细胞团重悬于100 μL的PBS中，以备流式检测.

1.6.2 脾脏样本 将所取脾脏组织放入盛有1640培养液的培养皿中冲洗，剥除周围结缔组织，放置于300目尼龙滤膜上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，至无组织团块时，取1 mL含0.1%血清的PBS冲洗针芯及滤膜，吸取脾细胞悬液共3 mL加入流式上样管中，以备检测.

1.7 VVC细胞毒检测将AHH⁃1细胞接种于96孔板，在不同组别的孔中分别加入VVC（终浓度分别为（0.5 μg/mL、5 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL），对照组加入同体积1640培养液，空白组不含细胞.检测时间点分别为12 h、18 h、24 h和36 h，细胞培养完成后加入CCK⁃8试剂，共孵育2 h后用酶标仪测定450 nm波长（630 nm参考波长）的双波长.细胞存活率＝（OD实验组⁃OD空白组）/（OD对照组⁃OD空白组）×100%.

1.8 统计学处理采用SPSS21.0统计学软件进行单因素方差分析，数据以±s表示，P＜0.05表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 创伤弧菌感染后免疫组织病理变化阴性对照组脾脏及肠淋巴组织结构正常（图1A、2A）.弧菌感染后小鼠脾脏可见脾脏充血出血明显，被膜下有充血、出血改变，脾小结周围有明显的出血带，脾小结缩小或消失，脾小结内可见灶状出血，淋巴细胞碎裂、坏死改变，髓索内也可见网状内皮细胞增生和中性粒细胞浸润（图1B、1C）；肠淋巴结组织可见附近肠绒毛排列紊乱，脱落绒毛细胞变性、坏死，部分绒毛水肿明显，间质有蛋白渗出液，粘膜固有层、肌层和粘膜下层水肿，部分绒毛表面、绒毛内、粘膜和粘膜下层均有菌团侵入，部分淋巴结失去正常的形态结构，淋巴结内可见红细胞渗出，呈灶状出血，淋巴细胞碎裂、坏死改变（图2B、2C）.

图1 小鼠脾脏组织结构变化

图2 小鼠肠组织淋巴结结构变化

2.2 创伤弧菌感染后外周血免疫细胞变化

2.2.1 坏死/凋亡变化 流式检测结果显示，创伤弧菌感染后，小鼠外周血淋巴细胞出现明显坏死、凋亡，且以凋亡损伤为主，凋亡细胞数量显著高于对照组（图3）.

图3 创伤弧菌感染后外周血淋巴细胞坏死/凋亡变化

2.2.2 各淋巴细胞亚群变化 创伤弧菌感染组T细胞比例显著低于对照组，B细胞和NK细胞比例也分别有升高及降低的变化，但无统计学意义（图4）；T细胞亚群中，CD4＋T细胞明显减少，CD8＋T细胞及CD4＋/CD8＋T细胞比例也有相应降低，但差异无统计学意义（图5）.

2.3 创伤弧菌感染后脾脏淋巴细胞变化

2.3.1 坏死/凋亡变化 创伤弧菌感染脾脏淋巴细胞也有坏死凋亡发生（图6），且以凋亡改变尤为显著，坏死细胞相对数量较少，这也与病理观察到的结果相一致.

图6 创伤弧菌感染后脾脏淋巴细胞坏死/凋亡变化

2.3.2 各淋巴细胞亚群变化 创伤弧菌感染脾脏中T细胞和NK细胞比例明显较对照组降低，B细胞比例则明显高于对照组，均存在统计学意义（图7A）；T细胞亚群中，创伤弧菌感染组CD4＋T细胞明显低于对照组，CD4＋/CD8＋T细胞比例也显著降低（图7B）.

图7 创伤弧菌感染后脾脏不同淋巴细胞群比例变化情况

2.4 VVC的细胞毒作用VVC对淋巴细胞株AHH⁃1存活率影响存在一定的量效关系，0.5 μg/mL和5 μg/mL的VVC作用组AHH⁃1存活率无显著下降，VVC作用浓度超过20 μg/mL时AHH⁃1存活率均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01，图8）.

图8 创伤弧菌溶血素VVC对淋巴细胞株AHH⁃1毒性作用

3 讨论

机体的免疫系统可通过有效地启动抗感染免疫应答效应，从而发挥杀伤作用，清除入侵的病毒、细菌等病原微生物.淋巴细胞是机体发生免疫应答的主要作用细胞，其基本成分主要包括T细胞、B细胞、NK细胞等.不同淋巴细胞亚群的数量及构成是反映机体免疫功能状态的重要指标，也是各亚群细胞协同调节，实现机体免疫功能正常的必要条件［8］.因此，对感染机体外周血及脾等免疫组织内淋巴细胞的检测，可以为感染程度、机体免疫状态及临床表现的差异等提供有效启示.

本研究结果显示，亚致死剂量的创伤弧菌通过腹膜吸收入血后，可引起器官组织炎症反应和严重的血液循环障碍，并造成淋巴组织变性、坏死等结构上的损伤，而且流式细胞检测表明淋巴细胞受损方式以凋亡为主，这也与病理观察到的结果一致.关于创伤弧菌感染引起的病理变化及其相关致病因素的研究较多，已明确的致病因子包括溶血素、肠毒素、细胞毒素、蛋白酶、铁螯合物、粘附因子和血凝素等，其中溶血素除了增加血管通透性，更是导致细胞凋亡和坏死的重要元凶［9－10］.本研究体外实验也表明，一定浓度的创伤弧菌溶血素vvc可以显著降低淋巴细胞的存活率.因此，在创伤弧菌感染时，机体可通过凋亡、坏死方式直接损伤淋巴细胞，造成其数量、比例的变化，进而打破机体免疫平衡.

在淋巴细胞各亚群构成中，T细胞是其中的主要组分，数量最多，功能也最为复杂，如可直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，以及产生细胞因子等.绝大部分成熟的T细胞可经血流迁徙至脾脏、骨髓或淋巴结（如肠相关淋巴组织），并进行淋巴再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能，其中有超过一半的T细胞可进入脾脏白髓［11－12］.本研究结果中，创伤弧菌感染使外周血和脾脏T细胞比例均有显著降低，其中CD4＋T细胞下降明显，CD4＋/CD8＋T细胞比例也相应降低，表明机体细胞免疫功能减弱.CD4＋T是人体最重要的免疫细胞，其数量能够直接反映人体免疫功能，也是著名的HIV的攻击对象［13］.Leder⁃berger等［14］对HIV感染者的研究表明，若血液中CD4＋T数量低于200个/μL，机会性感染的风险上升2.5倍，若低于50个/μL，这种风险将会上升到5.8倍.而CD8＋T细胞是介导细胞毒性反应的效应细胞，其增多会引起免疫抑制反应［15］.因此，CD4＋和CD8＋T细胞二者之间的比值是衡量机体免疫功能是否稳定的重要依据，其降低则提示免疫功能下降，反映感染进程的加重且影响预后［16］.

而B细胞在血液和淋巴结中的数量相对较少，也可经血流迁出至脾脏和淋巴结，受抗原刺激后可产生抗体发挥体液免疫的功能［17］.虽然B细胞通过与T细胞相同的途径定居至脾脏和淋巴结，但其在脾脏中的循环数量远高于外周淋巴结［13］.本研究结果中，创伤弧菌感染使外周血和脾脏B细胞比例有所升高，表明机体体液免疫功能在感染后受损伤较小，甚或有所提升.除了T细胞和B细胞，NK细胞也是同样重要的免疫效应细胞，虽数量不多，但在机体防御病原微生物感染和抗肿瘤方面发挥着及其重要的作用［18－19］.NK细胞在体内分布非常广泛，根据表面标志不同又可分为不同亚群，存在于外周血中的NK细胞既可诱导针对靶细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，又可产生多种不同类型的细胞因子［20］，而肝脏、脾脏等其它组织中的NK细胞功能则与其周围的微环境状态密切相关，不同组织中NK细胞的分化、成熟过程及其细胞毒活性都显示出明显差异［21－22］.本研究中创伤弧菌感染后NK细胞比例也有一定程度降低，有可能是创伤弧菌及其毒力因子的细胞毒作用所致，也不排除其本身抗菌过程中存在一定的消耗，提示创伤弧菌感染后，依赖于NK细胞的抗感染免疫功能也受到影响.

总体而言，重要海洋致病弧菌除了导致宿主免疫组织极显著的血液循环障碍，同时也导致淋巴细胞发生凋亡、坏死性损伤，各亚群构成平衡也相应被打破，从而进一步破坏机体免疫力.因此，弧菌感染对机体免疫组织细胞的破坏作用，可能导致感染后期发生免疫抑制，进一步加重继发感染.提示在弧菌感染后的诊治过程中，有必要进行相关免疫指标监测，考虑从免疫学角度探寻提高其诊治疗效的新手段.

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Study on the effects of Vibrio vulnificus infection on host immune system

FU Kai-Fei，LIU Jian-Fei，WANG Yu-Xiao，WU Cheng-Lin，QIN Ke-Wei，ZHOU Li-Jun
Center for Basic Medical Science，Navy General Hospital，Beijing 100048，China

AIM：To study the effect of Vibrio vulnificus，an im⁃portant marine pathogen，on immune organs and tissues of mice，so that to provide new ideas for effective diagnosis and treatment of infection.METHODS：BALB/c mice were infected with suble⁃thal doses of Vibrio vulnificus，then the pathological changes of the spleen and gut associated lymphoid tissues were observed with mi⁃croscopy，and the lymphocyte necrosis/apoptosis and lymphocyte subsets distribution changes of application in peripheral blood and spleen were detected by flow cytometry.On the basis of synthetic Vibrio vulnificus cytolysin（VVC），the lymphocyte damage from main toxicity factor of Vibrio vulnificus were tested with the cell counting Kit⁃8（CCK⁃8）cytotoxic experiment.RESULTS：There were obvious structural changes in the spleen and intestinal related lymphatic tissues of mice after Vibrio vulnificus infection，and the bleeding/congestion was obvious，and the lymphocytes appeared to be fragmentation and necrosis.After Vibrio vulnificus infection，the dominant lymphocyte damage in the peripheral blood and spleen was apoptosis，and the lymphocyte subset lost the normal proportion，more specifically，the number of CD4＋T cell group decreased significantly，the proportion of CD4＋/CD8＋T cells also significantly reduced（P＜0.05）.In vitro cytotoxicity test also showed that a certain concentration of VVC could significantly re⁃duce the survival rate of lymphocytes（P＜0.01）.CONCLUSION：Vibrio vulnificus infection can cause significant damages to the host immune tissue cells，which may lead to immunosuppression in the later stages of infection and further aggravate secondary infection.

Vibrio vulnificus；immune tissue；Vibrio vulnificus cytolysin；lymphocyte；flow cytometer detection

R378.3

A

2017－08－29；接受日期：2017－09－10

国家自然科学基金（31400107）；军队医药卫生重点课题（BHJ14J004）

付凯飞.博士.E⁃mail：fukaifei＠sina.com

周丽君.博士，研究员.研究方向：抗体工程学、细胞与分子免疫学.E⁃mail：hzzhoulj＠126.com

2095⁃6894（2017）10⁃16⁃04