秀珍菇液态发酵及主要活性成分分析

耿伟涛，李炳功，刘珊，郭金体，李超，王艳萍，*

（1.天津科技大学新农村发展研究院，天津300457；2.天津宝地农业科技发展有限公司，天津300457）

秀珍菇液态发酵及主要活性成分分析

耿伟涛1，李炳功1，刘珊1，郭金体2，李超1，王艳萍1，*

（1.天津科技大学新农村发展研究院，天津300457；2.天津宝地农业科技发展有限公司，天津300457）

为了秀珍菇的进一步开发利用，对秀珍菇进行了7L气升式发酵罐培养，并对其发酵液和菌丝体浸提液中的功能成分进行了分析。结果表明秀珍菇发酵至第6天时菌体干重达到16.53 g/L，发酵液和菌丝体浸提物中含有多糖、蛋白质、黄酮和多酚等功能成分。经检测，在发酵液中，多糖、蛋白质、黄酮和多酚的含量分别为0.672、0.052、0.126、0.122mg/mL；而菌丝体浸提液中，多糖、蛋白质、黄酮和多酚的含量分别为0.312、0.031、0.116、0.109 mg/mL。本研究表明，秀珍菇的液态发酵可获得较高含量的活性成分，为秀珍菇的进一步开发和利用提供了理论基础和技术支持。

秀珍菇；液态发酵；成分分析

秀珍菇又名小平菇，隶属于侧耳科侧耳属，作为人类食用的一种大型真菌，具有高蛋白、高膳食纤维、低脂肪、低能值、富含矿物质和多种维生素等优点，并且还含有真菌多糖、糖蛋白、生物碱等多种活性物质[1-2]，已经有研究证实这些活性成分具有抗癌、抗病毒、增强免疫、降低胆固醇和保肝作用[3-4]。液态发酵培养可以通过控制发酵条件使培养环境的理化参数易于控制，便于机械化操作，规范生产工艺，从而实现生产的工业化[5-6]。此外，液态发酵秀珍菇菌丝体的过程中可以获得一些代谢产物。之前国内外对于秀珍菇营养成分的研究大多局限于子实体。而近期的研究表明，深层培养食用菌菌丝体的营养价值更高，其多糖、蛋白质和氨基酸的含量均接近或超过了子实体[7]。因此，对秀珍菇液态发酵产物的研究更具有现实意义，且更适合工业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试秀珍菇菌株（Pleurotus geesteranus）：由宝地农业科技发展有限公司提供。

没食子酸（分析纯）：北京化学试剂公司；牛血清白蛋白（分析纯）：上海蓝季科技发展有限公司；苯酚（分析纯）、Na2HPO4·12H2O（分析纯）：天津市四通化工厂；NaH2PO4·2H2O（分析纯）：天津大学科威公司。

1.2 仪器与设备

MA300A磁力搅拌器：日本YAMATO公司；BIOTECH-5BGZ型气升式发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司；JA2003型电子分析天平：上海精科天平厂；可见分光光度计722E：北京瑞利分析仪器公司；SM-510型全自动灭菌锅：日本YAMATO公司；5415D型离心机：德国EPPENDORF公司。

1.3 培养基配制

液体发酵培养基（以每升计）

可溶性淀粉20 g，煮沸溶解，酵母浸粉5 g；KH2PO42 g；MgSO41 g；pH 值自然。

培养基灭菌条件：高压蒸汽灭菌，121℃，20 min。

1.4 7L气升式发酵罐培养

在前期试验的基础之上，进行7L气升式发酵罐培养。发酵罐工作体积为5 L，通气量为0.3 Nm3/h，发酵6 d，每24 h取样，测定其菌丝体生物量、pH值、胞外粗多糖含量，并绘制发酵曲线。

1.5 菌丝体干重的测定

将秀珍菇发酵液用布氏漏斗抽滤后，将菌丝体在60℃干燥箱中烘干至恒重。取出称重后，减去滤纸片的重量，即为秀珍菇的菌丝体干重。

1.6 发酵液及菌体浸提液的制备

经过发酵培养获得的秀珍菇发酵培养物经过真空抽滤，将发酵液和菌丝体分开。把菌丝体置于60℃烘箱中烘干，然后研磨呈粉末状。称取1 g的干菌丝体于40 mL蒸馏水中，再将其置于45℃，超声45 min，再于 90 ℃水浴 1 h，冷却，离心 20 min，8 000 r/min，将沉淀菌体除去，得到的上清液即为胞内物质的浸提液。

1.7 发酵液中胞外多糖及菌丝体中胞内多糖的制备

将发酵液、菌体浸提液分别置于透析袋（6 000 Da～8 000 Da）透析，直至透析液中无单糖检测出为止。

1.8 发酵液成分分析

1.8.1 苯酚-硫酸法测定秀珍菇发酵产物中胞外多糖和胞内多糖的含量[8]

取发酵培养第6天的秀珍菇发酵液与菌丝体浸提液，采用苯酚-硫酸法测定秀珍菇发酵液中胞外多糖和胞内多糖的含量。

1.8.2 Bradford法测定秀珍菇发酵产物中蛋白质含量[9]

取发酵培养第6天的秀珍菇发酵液与菌丝体浸提液，采用Bradford法测定秀珍菇发酵产物蛋白质含量。

1.8.3 NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法测定秀珍菇发酵产物中总黄酮含量[10]

取发酵培养第6天的秀珍菇发酵液与菌丝体浸提液，采用NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法，测定秀珍菇发酵产物中总黄酮含量。

1.8.4 Folin-Ciocaltue法测定秀珍菇发酵产物中多酚含量[11]

取发酵培养第6天的秀珍菇发酵液与菌丝体浸提液，采用Folni-Ciocaltue法，测定秀珍菇发酵产物中多酚含量。

2 结果与讨论

2.1 7L气升式发酵罐发酵培养

采用摇瓶优化的培养基和工艺条件，对秀珍菇进行扩大式培养，考察其在7L气升式发酵罐中菌丝体生物量、胞外粗多糖和pH值随发酵时间的变化规律，具体结果如图1、图2所示。

图1 秀珍菇发酵过程中生物量、胞外粗多糖的变化Fig.1 The growth curve of submerged culture of Pleurotus geesteranus in 7 L airlift fermenter

图2 秀珍菇发酵过程中pH值的变化Fig.2 The pH curve of submerged culture of Pleurotus geesteranus in 7 L air-lift fermenter

菌丝体是生物发酵过程中的一个重要指标，在发酵过程中，1 d～2 d菌丝体前期生长缓慢，随后加速增加，到第6天时达到最大值16.53 g/L，随后进入相对稳定的阶段；发酵液中胞外粗多糖随着菌丝体生长开始代谢分泌产生，随着时间延长，含量不断增加到第6天时，达到2.23 g/L，并随着发酵天数的延长还在增加，但当发酵进入平稳期时多糖产量的增加也趋于平稳，增加量很小，发酵7 d时，多糖产量为2.35 g/L，第8天时为2.33 g/L，产量有所下降这与菌丝体生物量的增长趋势一致。pH值随着菌丝体基质分解代谢产生有机酸而逐渐下降，但pH值变化波动范围较小，从初始pH值为5.0降低到3.79；7L气升式发酵罐发酵秀珍菇周期为6 d，菌体生物量为16.53 g/L。

2.2 秀珍菇发酵液成分分析

2.2.1 秀珍菇发酵液中胞外多糖和胞内多糖的含量

苯酚-硫酸法测定粗多糖标准曲线：以葡萄糖含量（g/L）为横坐标（x），OD490nm值为纵坐标（y），绘制标准曲线（见图3）。所得方程为y=7.597 3x-0.004 1，相关系数R2=0.998 1。在0.02 mg/mL～0.12 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

图3 苯酚-硫酸法标准曲线Fig.3 Standard curve of phenol-sulfuric acid method

取上述方法制备的秀珍菇发酵液与菌丝体浸提液，根据标准曲线计算得出秀珍菇发酵液中的多糖含量为0.672 mg/mL，菌丝体浸提液中的多糖含量为0.312 mg/mL。

2.2.2 秀珍菇发酵产物中蛋白质含量

Bradford法测蛋白质标准曲线：以牛血清白蛋白含量（μg/mL）为横坐标（x），OD595nm值为纵坐标（y），绘制标准曲线（见图4）。所得方程为y=0.007 3x+0.018 8，相关系数 R2=0.997 7。在 10 μg/mL～100 μg/mL 范围内呈良好线性关系。

取上述方法制备的秀珍菇发酵液与菌体浸提液，根据标准曲线计算得出秀珍菇发酵液中蛋白质含量为0.052 mg/mL，菌丝体浸提液的蛋白质含量为0.031 mg/mL。

2.2.3 秀珍菇发酵产物中总黄酮含量

NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法测黄酮标准曲线：以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标（x），OD510nm值为纵坐标（y），绘制标准曲线（图5）。所得方程为y=1.026 4x－0.011 8，相关系数R2=0.998 4。在0.1 mg/mL～0.6 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

图4 Bradford法标准曲线Fig.4 Standard curve of Bradford method

图5 NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法标准曲线Fig.5 Standard curve of NaNO3-Al（NO3）3-NaOH method

取上述方法制备的秀珍菇发酵液与菌丝体浸提液，根据标准曲线，计算得出秀珍菇发酵液中黄酮含量为0.126 mg/mL，菌丝体中黄酮含量为0.116 mg/mL。

2.2.4 秀珍菇发酵产物中总多酚含量

Folni-Ciocaltue法测多酚标准曲线：以没食子酸浓度（mg/mL）为横坐标（x），吸光值OD755nm值为纵坐标（y），绘制标准曲线（图6）。所得方程为y=13.374x+0.013 8，相关系数 R2=0.998 9，在 0.01 mg/mL～0.6 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

图6 Folni-Ciocaltue法标准曲线Fig.6 Standard curve of Folni-Ciocaltue method

取上述方法制备的秀珍菇发酵液与菌丝体浸提液，根据标准曲线，计算得出秀珍菇发酵液和菌丝体浸提液中多酚含量分别为0.122、0.109 mg/mL。

3 结论

7L气升式发酵罐发酵培养结果表明，秀珍菇发酵周期为6 d，菌丝体生物量为16.53 g/L，胞外粗多糖产量为2.35 g/L，发酵最终pH值为3.77。秀珍菇发酵产物中含有多糖、蛋白质、黄酮和多酚等功能成分。其中，菌丝体浸提液中的多糖含量为0.312 mg/mL与熊芳[12]等测定的秀珍菇菌丝体中多糖含量0.288 mg/mL相近。发酵液中蛋白质含量为0.052 mg/mL，菌体浸提液的蛋白质含量为0.031 mg/mL。发酵液中黄酮含量为0.126 mg/mL，菌丝体中黄酮含量为0.116 mg/mL。发酵液中多酚含量为0.122 mg/mL，菌体浸提液中多酚含量为0.109 mg/mL。与赵丹等[13]测定的灵芝发酵液中多酚含量0.054 mg/mL、黄酮含量0.045 mg/mL相比，秀珍菇发酵液中的多酚和黄酮含量明显较高。本研究结果为秀珍菇的进一步开发利用提供了一定的理论基础和技术支持。

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The Liquid-fermentation Cultivation and Major Active Component Analysis of Pleurotus geesteranus

GENG Wei-tao1，LI Bing-gong1，LIU Shan1，GUO Jin-ti2，LI Chao1，WANG Yan-ping1，*
（1.Insititute for New Rural Development，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Baodi Agricultural Science and Technology Development Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

In order to further developPleurotus geesteranus，the present study was carried on the culture ofPleurotus geesteranusin 7L air-lift type fermentor，and the functional constituents in the fermentation broth and mycelium extract were analyzed.The results showed that the dry weight of mycelium reached 16.53 g/L at the 6th day，and the polysaccharide，protein，flavone and polyphenol were found in the fermentation broth and mycelium extract.The results showed that the contents of polysaccharides，proteins，flavones and polyphenols in the fermentation broth were 0.672，0.052，0.126，0.122 mg/mL，respectively.And the corresponding contents of the four functional components were 0.312，0.031，0.116，0.109 mg/mL in the mycelium extracts respectively.The results showed that the liquid fermentation ofPleurotus geesteranuscould obtain high content of active components，which provided the theoretical basis and technical support for the further development and utilization ofPleurotus geesteranus.

Pleurotus geesteranus；liquid fermentation；component analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.039

天津市科技计划项目（13ZCZDNC06500）；天津科技大学新农村发展研究院开放基金资助项目（xnc201509）

耿伟涛（1985—），男（汉），讲师，博士研究生，研究方向：食品微生物。

*通信作者：王艳萍（1962—），女，教授，博士研究生，研究方向：食品微生物。

2017-03-03