樱桃番茄果脯中矮壮素检测方法的建立

赵炳喃，韩悦，尹仁，张双灵，*

（1.青岛市城阳第一高级中学，山东青岛266109；2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

樱桃番茄果脯中矮壮素检测方法的建立

赵炳喃1，韩悦2，尹仁2，张双灵2，*

（1.青岛市城阳第一高级中学，山东青岛266109；2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

樱桃番茄果脯为我国的出口创汇产品，矮壮素残留逐渐成为制约其出口的瓶颈，研究建立一种矮壮素残留的检测方法。以樱桃番茄果脯为研究对象，通过甲醇提取矮壮素，对提取物采用强阳离子柱固相萃取（SPE）分离净化，采用高效液相色谱/质谱/质谱进行检测，并对检测方法的可靠性进行分析。结果表明，建立的检测方法检出限和定量下限分别为0.01 mg/kg和0.02 mg/kg，加标回收率在73.33%～90.60%之间，精密度在3.34%～7.87%之间。该检测方法为调查番茄加工品中矮壮素本底含量以及为后续降解矮壮素残留提供方法基础。

樱桃番茄；矮壮素；固相萃取（SPE）；检测方法

矮壮素（Chlormequat chloride）是2-氯乙基三甲铵氯化物的商品名称，因其抗倒伏、矮化农作物的作用而得名，在常温下是白色晶体，有鱼腥味，原药为淡黄色晶体，在中性和微酸性溶液中稳定，遇碱易分解[1-3]。矮壮素能抑制植物细胞伸长，但不抑制细胞分裂，具有增加番茄、橄榄、葡萄和梨的坐果率等功能[4-6]。矮壮素为内吸性农药，由于其提高作物产量的显著作用而被作为植物生长调节剂大量使用。

随着矮壮素的逐步推广使用，其残留的毒性危害在国内外被广泛研究。动物学实验发现，高剂量的矮壮素对受试动物的生殖能力有毒害作用，即使动物每天摄入的矮壮素低于人类每日允许摄入量（Allowable Daily Intake，ADI），也会对其生殖能力产生不良的影响[7-9]。美国国立职业安全与健康研究所将矮壮素列为潜在内分泌干扰物[10]。欧盟（EU）根据矮壮素的毒性制定了矮壮素在食物中的最大残留量[11-12]。由于我国种植业的散乱分布现状，水果中矮壮素的使用非常普遍，已经出现多例番茄果脯中矮壮素残留超标被退回的案例[13-14]。矮壮素超标成为我国农产加工品出口创汇的新出现瓶颈。

目前，我国尚未制定检测水果及其加工品中矮壮素残留的检测方法。近年，有文献探讨了番茄中矮壮素的检测方法，主要有气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法[15-16]。但采用气相色谱时需衍生化处理，衍生效率易受基质的影响[17]。而液相色谱不需要衍生可直接测定[18-20]。本研究在国内外有关文献的基础上，选用樱桃番茄加工品为研究对象，采用强阳离子固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）进行分离净化，强阳离子固相萃取小柱可键合带有季铵盐官能团的阳离子[21]，建立了水果加工品中矮壮素的高效液相色谱/质谱/质谱检测方法，其中质谱测量结果用于矮壮素的定性，外标法进行定量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樱桃番茄：烟台某食品有限公司；氯化钙、蔗糖：食品级，市售；矮壮素标准品（纯度＞99%）：sigma公司；偏磷酸（分析纯）：莱阳康德化工有限公司；乙腈、甲醇、甲酸胺（色谱纯）：德国Merck公司；固相萃取柱：Wa ters Oasis MCX（60 mg/3 cc）：天津德祥茂隆科技有限公司；0.45 μm有机微孔滤膜：上海兴亚净化材料厂。

1.2 仪器与设备

AR224CN型电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；JYL-C021九阳料理机：九阳股份有限公司；DKZ系列电热恒温振荡水槽：上海一恒科技有限公司；减压抽滤装置（配AP-01P型真空泵）：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；HSE-12D型固相萃取仪：天津恒奥科技发展有限公司；VORTEX振荡器：IKA集团；ZMQ S5V001超纯水系统：美国密理博；1290高效液相色谱仪（配紫外检测器）、6460电喷雾串联四极杆质谱仪：美国Agilent公司；常规实验室玻璃仪器若干。

1.3 方法

1.3.1 樱桃番茄果脯的制作

青岛农业大学食品风险分析实验室自制樱桃番茄果脯，工艺如下。

1）原料挑选：选取500 g新鲜、成熟度一致、无病虫害的樱桃番茄作为原料。

2）去蒂：去掉樱桃番茄的蒂。

3）扎孔：使用牙签均匀扎孔，孔间距为1 mm。

4）清洗：流水冲洗1 min。

5）硬化：2 L1%氯化钙浸泡硬化18 h。

6）水煮：置于沸水中，水温为100℃时，水煮2min。

7）浸糖：分别使用糖度为 15、23、28 °BX 糖液浸泡24 h。

8）烘烤：65℃干燥，10 h。至不黏手，得樱桃番茄果脯成品，待测。

1.3.2 标准曲线的制作

矮壮素标准使用液：准确吸取1 mL 1 000 μg/L矮壮素标准贮备液（由标准品配制）于10 mL容量瓶中，用超纯水定容，得100 μg/L的标准溶液，逐级稀释制备成 0.5、1、5、10、15 μg/L 的矮壮素标准使用液。取各浓度的矮壮素标准使用液上机测定，得矮壮素标准曲线。

1.3.3 样品前处理

准确称取100.0g（精确至0.01g）实验室自制果脯加工品，研磨成匀浆。准确称取5.00 g（精确至0.000 1 g）于具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇：1%偏磷酸（1∶1，体积比），振荡提取10 min，减压过滤。取10 mL甲醇：1%偏磷酸（1∶1，体积比）清洗残渣，合并滤液，用甲醇：1%偏磷酸（1∶1，体积比）溶液定容至50 mL容量瓶中，混匀。

矮壮素的分离纯化：取2.5 mL滤液于小烧杯中并加入5 mL蒸馏水。分别使用5 mL甲醇和蒸馏水活化固相萃取柱，上样，然后分别用5 mL蒸馏水和甲醇淋洗。准确使用2.5 mL甲酸铵（含有1 mol/L乙腈）：水（体积比为1∶3）洗脱，接收洗脱液，振荡混匀10 min。使用0.45 μm有机微孔滤膜过滤，滤液上机检测。

1.3.4 高效液相色谱/质谱/质谱法测定

HPLC条件：色谱柱：Agilent ZORBAX RX-SIL柱（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；检测器：紫外检测器，波长275 nm；流动相：含1 mol/L甲酸铵的乙腈∶水（体积比为 1 ∶3）；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：1 μL。

MS/MS条件：电喷雾正离子（ESI+）扫描模式；毛细管电压4 000 V；干燥气温度：300℃；干燥气流量：10 L/min；雾化器压力 276 KPa。

1.3.5 矮壮素残留量的计算

矮壮素残留量的计算公式为：

式中：X为样品中矮壮素的残留量，mg/kg；m为样品匀浆的质量，g；c为由标准曲线查得矮壮素的质量浓度，μg/L；v为固相萃取后的样液体积，L；v1为样品匀浆准确定容体积，mL；v2为纯化的样品滤液体积，mL。

1.3.6 检测方法的可靠性

1.3.6.1 回收率和精密度

向5.00 g（精确至0.000 1 g）实验室自制的果脯加工品中加入相当于0.01、0.05、0.50 mg/kg 3个水平浓度的矮壮素标准液进行加标回收率试验，计算平均回收率和精密度。

式中：P为样品的加标回收率；R1为未加标样品中矮壮素的残留量，mg/kg；R2为加标样品中矮壮素的残留量，mg/kg；R0为加标量，mg/kg。

1.3.6.2 测定方法的检出限

对果脯加工品的矮壮素提取液逐级稀释，以3倍信噪比（S/N≥3）设定仪器检出限，5倍信噪比（S/N≥5）设定仪器定量下限，得出方法的检出限和定量下限。

2 结果与分析

2.1 标准品液质图

矮壮素标准品的高效液相色谱/质谱/质谱图如图1、图2所示。

图1 矮壮素标准品高效液相色谱图Fig.1 HPLC of chlormequat chloride

图2 矮壮素标准品质谱图Fig.2 MS of chlormequat chloride

由图1高效液相色谱图可以得出，1.3.4试验条件下，矮壮素保留时间为3.151 min。矮壮素为脂肪胺盐类物质，在进入一级质谱后能产生稳定的[M-Cl]分子离子（122.0），[M-Cl]离子作为母离子进入二级质谱发生α断裂后，接着发生氢重排及i断裂并产生有显著丰度的m/z58.1及63.1的离子碎片，由图2可见，定性离子选择丰度较高的m/z58.1。

2.2 标准曲线及线性范围

矮壮素标准曲线如图3。

根据回归方程y=2 134.1x+161.35和线性相关系数R2=0.998 6，可知此方法在0～15 μg/L的浓度范围具有良好的线性关系。

2.3 番茄加工品矮壮素残留量

经3次重复测定并计算，得果脯中矮壮素残留量为0.150 mg/kg。以此含量为实验室自制樱桃番茄果脯中矮壮素的本底含量，并进行回收率试验。

图3 矮壮素的标准曲线图Fig.3 Standard curve of chlormequat chloride

2.4 检测方法的可靠性

2.4.1 加标回收率和精密度

加标回收率和精密度结果见表1。

表1 矮壮素加标回收率及精密度（n=3）Table 1 Average recoveries and RSD of chlormequat chloride（n=3）

续表1 矮壮素加标回收率及精密度（n=3）Continue table 1 Average recoveries and RSD of chlormequat chloride（n=3）

由表1可知，方法的加标回收率在73.33%～90.60%之间，精密度在3.34%～7.87%之间，说明该方法测量樱桃番茄加工品中矮壮素残留量较为可靠。

2.4.2 方法的检出限

根据前述方法得出的检出限和定量下限分别为0.01 mg/kg和 0.02 mg/kg。

3 结论

以樱桃番茄加工品为研究对象，采用甲醇提取，强阳离子固相萃取方式分离纯化了矮壮素，并使用液相色谱/质谱/质谱方式进行了检测。方法的加标回收率为73.33%～90.60%，精密度为3.34%～7.87%，检出限低至0.01 mg/kg。该方法能够满足目前矮壮素的检测需求，为摸清番茄加工品中矮壮素的本底含量和果脯中矮壮素的脱除奠定了方法基础。

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The Detection Method of Chlormequat Chloride in Cherry Tomato Preserves

ZHAO Bing-nan1，HAN Yue2，YIN Ren2，ZHANG Shuang-ling2，*
（1.Chengyang NO.1 High School of Qingdao，Qingdao 266109，Shandong，China；2.College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

Cherry tomato preserves are agricultural products for export in China，and the residues of chlormequat chloride have become a bottleneck restricting its export，therefore，a detection method of the residues was established.The processed products of cherry tomato preserves were selected as the research object，the chlormequat chloride was extracted through the methanol，then the extraction was separated and purificated by strong cation solid-phase extraction （SPE）and detected by HPLC/MS/MS，the reliability of detection method was analyzed at the same time.The results showed that the detection and quantification limit of the method was 0.01 mg/kg and 0.02 mg/kg respectively，the recovery was 73.33%-90.60%and the precision was 3.34%-7.87%.The method provided a basis for the investigation of the content of chlormequat chloride in tomato and the degradation of chlormequat chloride residues.

cherry tomato；chlormequat chloride；solid-phase extraction（SPE）；detection method

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.037

赵炳喃（2000—），男（汉），高中在读，研究方向：饮食安全。

*通信作者：张双灵（1974—）女，副教授，博士，主要从事食品安全检测方面的相关研究。

2017-03-04