液相色谱-串联质谱法法快速检测猪肉中盐酸克伦特罗

陈蕾，石盼盼，魏法山，朱凯，吴丽

（1.河南省产品质量监督检验院，河南郑州450000；2.河南牧业经济学院，河南郑州450000）

液相色谱-串联质谱法法快速检测猪肉中盐酸克伦特罗

陈蕾1，石盼盼1，魏法山1，朱凯1，吴丽2，*

（1.河南省产品质量监督检验院，河南郑州450000；2.河南牧业经济学院，河南郑州450000）

建立猪肉中盐酸克伦特罗的快速提取方法，优化了液相色谱-质谱质谱联用仪（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）的分析条件，实现了猪肉中盐酸克伦特罗的快速检测分析。试验确定了利用乙腈快速提取猪肉中盐酸克伦特罗，研究了样品经乙腈快速提取后的净化方法，对比了填充料的类型，填充料的加入量及无水MgSO4的加入量3方面对提取净化效果的影响。试验结果显示，该方法盐酸克伦特罗在0.15 μg/L~1.5 μg/L范围内具有良好的线性关系，检出限可达到0.5 μg/L，平均回收率在80%~120%范围内，相对标准偏差（Rlative SandardDeviation，RSD）为0.47%。本方法可缩短检测时间，方法快速、简单、可靠，可用于猪肉中盐酸克伦特罗的快速测定。

盐酸克伦特罗；快速提取；液相色谱-串联质谱法；猪肉

盐酸克伦特罗，化学名2[（叔丁氨基）甲基]-4-氨基3，5-二氯苯甲醇盐酸盐，简称克伦特罗，俗语称“瘦肉精”。20世纪80年代初发现，将一定量的盐酸克伦特罗添加到动物饲料中会改变动物体内脂肪和蛋白质的代谢途径，降低动物体内脂肪含量，使瘦肉率提高9%~14%。盐酸克伦特罗是肾上腺类神经兴奋剂，属于β-兴奋剂类药物，与其他β-兴奋剂类药物相比其药理性质稳定，进入动物体后，会以原药形态残留在肌肉和内脏组织中。长期食用含盐酸克伦特罗的猪肉会严重影响人的身体健康[1]。

我国农业部公告第176号《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品目录》、第193号《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》、第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》中均将盐酸克伦特罗列为第一位。其他类似药物还有沙丁胺醇（salbutamol）和特布他林（terbutaline）等，均能起到瘦肉作用，统称为“瘦肉精”。瘦肉精曾在上海引发了几百人的中毒事件[2]，但某些养殖户为了缩短出栏时间，降低成本，提高利润，仍然在饲料中非法添加盐酸克伦特罗。

目前测定猪肉中盐酸克伦特罗的方法主要有气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、酶联免疫吸附法、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）[3-8]。但这些方法的检测时间均较长，而猪肉的出栏和市场的销售却是在很短时间内完成的，因此市场需要更为快速的检测方法来满足实际需求。随着GC-MS/MS技术的成熟，样品的分析条件基本已达到最优，近年来的研究主要致力于前处理方法的革新[9-14]。本文用液相色谱串联质谱法检测猪肉中的盐酸克伦特罗，与国标GB/T22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》相比[15]，采用乙腈提取、吸附剂净化的快速前处理方法，省去了国标方法中12 h的酶解时间，并且优化了液相色谱质谱联用的分析条件，方法兼顾了效率与准确。本法可用于猪肉样品中盐酸克伦特罗的快速检测，提高大宗食品的检验效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉样品购自某大型超市。

盐酸克伦特罗标准品、同位素内标物克伦特罗-D9：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；中性氧化铝、无水硫酸镁（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯）：上海融禾医药科技发展有限公司；N-丙基乙二胺填料（PSA填料）、C18填料、氨基填料（NH2填料）：上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

液相色谱-质谱联用仪（1290-6460A）：美国安捷伦公司；超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；CT14RD台式高速冷冻离心机；IKA涡旋混匀器：上海人和科学仪器有限公司；电子天平（d=0.0001g）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；匀浆机：上海臣迅信息科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

1.3.1.1 提取

将成块的猪肉样品用粉碎机粉碎成肉糜状，准确称取2.0 g（精确到0.1 mg）于50 mL离心管中，吸取盐酸克伦特罗外标液50 μL，同位素内标物克伦特罗-D9配制成的内标液50 μL（内外标浓度均为100 ng/mL）于离心管内，准确加入5.0 mL乙腈，涡旋混匀，超声提取30 min，加入2.5 g中性氧化铝，涡旋混匀，以10 000 r/min，4℃，高速离心5 min，上清液即为盐酸克伦特罗提取液。

1.3.1.2 净化

取1.5mL样品提取液，转入2mL的离心管中，加入一定量的吸附剂和无水硫酸镁后涡旋混匀，12000r/min离心5 min，取上清液用有机滤膜过滤后取1 mL加入进样品瓶中。

1.3.2 标准溶液的配制[15]

1.3.2.1 克伦特罗标准储备液的配制

准确称取适量的克伦特罗标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的标准储备液，-18℃冰箱内避光保存。再用甲醇稀释1000倍配制成100 ng/mL的标准储备液，-18℃冰箱内避光保存。

1.3.2.2 克伦特罗标准使用液的配制

分别吸取100 ng/mL的克伦特罗标准储备液0.150、0.375、0.70、1.50 mL 于 100.0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别配制成0.15、0.375、0.75、1.5 ng/mL的克伦特罗标准使用液。临用时配制。

1.3.3 同位素内标物的配制[14]

1.3.3.1 同位素内标储备液的配制

准确称取内标物克伦特罗-D9标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的标准储备液，-18℃冰箱内避光保存。

1.3.3.2 同位素内标工作溶液（100 ng/mL）

吸取同位素内标储备溶液1.0 mL于1 000 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。配制成100 ng/mL的克伦特罗-D9同位素内标工作液，于-18℃冰箱内避光保存。

1.3.4 LC-MS/MS分析条件

色谱分析条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；进样量：10 μL；柱温：40 ℃，始终保持；流速：0.3 mL/min；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸水；梯度程序：0~3 min,B：98%~30%；3 min~3.5 min，B：30%保持不变；3.5 min~4.5 min，B：30%~98%；4.5 min~6 min,B：98%保持不变。

质谱条件：电离模式：ESI+检测方式：多反应监测MRM；干燥器温度：320℃；干燥器流量：10 mL/min；雾化器压力：3.1×105Pa；鞘流气温度：350℃；鞘流气流量：11 mL/min，毛细管电压：3 500 V，喷嘴电压：500 V；MRM参数见表1，安捷伦Mass Hunter软件用于定性和定量分析。

表1 MRM主要参数Table 1 The main parameters of MRM

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

比较了EclipsePlusC18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），Extend-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和 SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）3种不同类型的色谱柱，以及柱子温度,流动相的配比和流速对样品分离效果的影响，经过反复试验，发现在1.3.4的条件下，盐酸克伦特罗的分离效果最佳。

2.2 净化条件的选择

2.2.1 不同吸附剂吸附效果结果

在液相色谱试验中，吸附剂的选择非常关健。以1.3.1.1的方法提取样品后,在提取液中加入100 mg无水硫酸镁，平均分成3份，分别添加100 mg的PSA、100 mg的C18和100 mg的NH2吸附剂净化提取液，每种处理取3个平行，处理好后，依照1.3.4的分析条件上LC-MS/MS，结果如图1~图3所示。

图1 C18净化后的样品色谱图Fig.1 Chromatogram of C18as adsorbent

C18和NH2作为吸附剂时，其目标峰附近杂质较多，净化效果不理想；而PSA作为吸附剂时，杂质较少。此外，PSA作为吸附剂时其样品平均回收率为93.41%，高于C18的85.95%和NH2的91.16%。因此，3种吸附剂中，PSA净化效果最佳。

图2 NH2净化后的样品色谱图Fig.2 Chromatogram of NH2as adsorbent

图3 PSA净化后的色谱图Fig.3 Chromatogram of PSA as adsorbent

2.2.2 不同含量PSA净化结果

不同吸附剂的吸附效果不同，同一种吸附剂添加量不同，所表现出的吸附效果也有差异。用1.3.1.1的方法提取样品后，在提取液中加入100 mg无水硫酸镁，然后分别添加 50、100、150、200 mg的 PSA 吸附剂净化提取液，每个处理取3个平行，结果如表2所示。

表2 不同含量PSA净化后的加标回收率（n=3）Table 2 Recovery with different content PSA（n=3）

从表2中可以看出，随着PSA加入量的增多，样品的回收率逐渐增大，但从150 mg~200 mg变化很小，故选择PSA的最优添加量为150 mg。

2.3 添加不同含量无水硫酸镁的结果

无水硫酸镁可以吸收提取液中的水分，添加量的多少会对同等条件下的试验产生影响。用1.3.1.1的方法提取样品后，在提取液中加入150 mg PSA，然后分别添加 50、100、150、200、250 mg 的无水硫酸镁去除水分后按照1.3.4设置的参数上机测试，每个处理取3个平行，结果见表3。

表3 不同含量无水MgSO4净化后的加标回收率（n=3）Table 3 Recovery with different content anhydrous MgSO4（n=3）

由表3可知，当无水硫酸镁的量为100 mg时，回收率最大，随着无水硫酸镁量的增加，回收率下降趋势明显，因而无水硫酸镁最佳添加量为100 mg。

2.4 回归曲线

用浓度梯度为 0.15、0.375、0.75、1.5 ng/mL 的克伦特罗标准溶液，进样10 μL按照1.3.4设置的参数上机，以峰面积Y对质量浓度X绘制标准曲线。在试验条件下，克伦特罗的浓度与峰面积在浓度范围0~1.5 ng/mL之间呈良好的线性关系，相关系数超过r=0.997 7，结果较为满意。

2.5 回收率与精密度试验

在空白样品（不含克伦特罗）中，加入克伦特罗外标液 10 μL，内标液 10 μL（内外标浓度均为 100 ng/mL）进行加标回收，在1.3.4设置的参数条件下测定，重复6次，克伦特罗的平均回收率是115.32%，相对标准偏差RSD为0.47%。

3 结论

本文建立了猪肉中盐酸克伦特罗的快速提取方法，并对提取物进一步净化处理，整个前处理时间不到1 h。本法操作简便，与标准方法（GB/T 22286-2008《动物源性食品中多重β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》）仅提取酶解时间就需要12 h相比提高了检验效率。在以下分析条件下：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流速：0.3 mL/min；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸水；梯度程序：0~3 min，B：98%~30%；3 min~3.5 min，B：30%保持不变；3.5 min~4.5 min，B：30%~98%；4.5 min~6 min，B：98%保持不变。电离模式：ESI+检测方式：多反应监测MRM；干燥器温度：320℃；干燥器流量：10 mL/min；雾化器压力：3.1×105Pa；鞘流气温度：350℃；鞘流气流量：11 mL/min，毛细管电压：3 500 V，喷嘴电压：500 V；裂解电压90V；碰撞能5，15 V。盐酸克伦特罗可在0.15 ng/mL~1.5 ng/mL范围内具有良好的线性关系，检出限可以达到现行的标准要求。添加量为0.5 ng/g时，回收率为115.32%，相对标准偏差RSD为0.47%。本方法对促进肉及肉制品中β-兴奋剂类药物的快速检测方法的开发有一定的借鉴意义。

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Rapid Detection of Clenbuterol in Pork with LC-MS/MS Methods

CHEN Lei1，SHI Pan-pan1，WEI Fa-shan1，ZHU Kai1，WU Li2，*
（1.Institute of ProductsQuality Supervision and Inspection in Henan Province，Zhengzhou 450000，Henan，China；2.College of Animal Husbandry and Economics in Henan Province，Zhengzhou 450000，Henan，China）

This paper established an rapid clenbuterol extraction method from pork by LC-MS/MS（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry）.LC-MS/MS analysis parameters were optimized，it can detect clenbuterol in pork rapidly.The extraction method with acetonitrile was determined.The type and amount of filling material and anhydrous MgSO4dosage for purification were studied.The results showed clenbuterol had a good liner relationship in the 0.15 μg/L-1.5 μg/L range.Detection limit can reach 0.5 μg/L，and average recovery was in the range of 80%-120%；relative standard deviation（RSD）was 0.47%.our method can shorten the time.It was rapid，simple and reliable，can be used to detect clenbuterol in pork rapidly.

clenbuterol；rapiddetectionmethod；liquidchromatography-massspectrometry/massspectrometry；pork

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.033

河南省重大科技专项“高温肉制品加工关键技术研究与应用”（161100110700）

陈蕾（1985—），女（汉），工程师，硕士研究生，主要研究方向：食品质量与安全。

*通信作者

2017-04-21