小反刍兽疫血清学检测方法研究进展

刘丹丹 ， 杜方原 ， 冯春燕 ， 张永宁 ， 王彩霞 ， 仇松寅 ，刘晓飞 ， 王 勤 ， 吴绍强 ， 林祥梅

(中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所 ， 北京 大兴 100176)

小反刍兽疫血清学检测方法研究进展

刘丹丹 ， 杜方原 ， 冯春燕 ， 张永宁 ， 王彩霞 ， 仇松寅 ，刘晓飞 ， 王 勤 ， 吴绍强 ， 林祥梅

(中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所 ， 北京 大兴 100176)

小反刍兽疫(Peste des petits ruminant,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantvrius，PPRV)引起的一种能感染家畜和野生小反刍动物的高度接触性传染病，被世界卫生组织(OIE)列为A类疫病。PPRV是副黏病毒科麻疹病毒属成员，仅存在一个血清型，主要感染山羊和绵羊。感染后康复及接种免疫后的动物可终身免疫。对急性、亚急性和症状不明显的感染及免疫后的动物进行精准的PPRV特异性抗体检测是目前血清学检测的重要研究方向。

目前，PPR的检测方法主要用来进行疫病诊断、疫病动态监测及其流行情况的调查，一些特殊检测手段也用于PPR的地理分布和传播特性的研究中。此外，为了实施精确有效的防控策略，有必要利用临床和血清监测手段来定位疫病暴发的地点并监控疫病的传播范围。更快捷、更有效和更环保的同时能被大多数实验室接受是目前PPR诊断试剂的研发方向。本文主要介绍现阶段PPRV血清学检测方法，以及相关抗原蛋白及抗原决定簇的研究进展。

1 PPRV不同病毒蛋白的免疫原性

抗原的免疫原性是通过体液免疫应答水平进行评估的。体液免疫能抑制病毒的复制，同时发生的细胞免疫反应也有助于杀死感染细胞。在野毒感染的急性期时表现出的过高热反应标志着体液免疫应答的开始。产生免疫后，1周左右出现抗体，3～4周左右上升至平台期。中和抗体是抵御病毒感染的第一道防线，对治疗麻疹病毒属病毒引起的疫病有重要的作用。PPRV能刺激机体产生IgM和IgG抗体，IgM很快消失，而IgG可稳定存在若干年，随后水平降低但不会消失。疫苗产生的免疫保护力可持续1～3年[1]。

PPRV 蛋白的免疫学特性与血清学诊断息息相关。PPRV基因组为单股负链RNA，共编码8种蛋白，其中6种是结构蛋白，包括核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、大蛋白(L)以及血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)[2]。6种结构蛋白中的3种病毒蛋白N、H和F可诱导产生免疫反应。蛋白N可诱导产生免疫反应，蛋白H和F诱导产生中和抗体。位于PPRV包膜内的F和H蛋白被制备成重组疫苗，用于免疫山羊。单独或共同表达的重组蛋白都可诱导机体产生免疫力。接种重组羊痘病毒制备的疫苗，首次免疫后即可产生中和抗体。中和抗体滴度可在6个月内保持较高的滴度，且在再次感染后会迅速升高。羔羊获得的母源抗体可抵御病毒侵害，说明PPRV抗体具有很强的保护效力[3]。

2 PPRV与同属病毒的血清交叉反应性

由于麻疹病毒属病毒的同源蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列相似，导致病毒之间具有交叉反应，是确诊的难点之一。蛋白质序列分析表明，同源蛋白的同源区域可能代表病毒的结构相同或功能等效的区域[2,4]。用于疫病诊断的血清学试验如免疫荧光法、补体结合试验和琼脂凝胶免疫扩散试验等，都表明在麻疹病毒属病毒的N、P、M、L和表面蛋白F中存在交叉反应。研究显示，至少在反应初期，麻疹病毒(MV)/犬瘟热病毒(CDV)、MV/牛瘟病毒(RPV)、RPV/PPRV以及CDV/海豚瘟热病毒(PDV)表现出成对的交叉保护性。这些组合，除RPV/PPRV之外均被随后的系统进化学研究所证实。研究表明，RPV/MV形成了系统进化的一个支系，而CDV/PDV 构成了另外一个支系。PPRV属 RPV/MV支系的一个分支[5]。这些病毒中，RPV需要与PPRV 做鉴别诊断，因为这两种病毒能在反刍动物中表现出相似的临床症状。当两种病毒的地理分布和宿主范围一致时，做血清学监测尤为困难。虽然RPV已经被根除，但仍需进一步研发PPRV特异性血清学方法以减少PPRV同其他麻疹病毒之间的交叉反应。

3 PPRV血清学诊断的靶蛋白

研究显示，在麻疹病毒属病毒的表面蛋白中，只有H蛋白引起的病毒间的交叉反应较小。该蛋白主要影响细胞噬性，与宿主特异性信号淋巴细胞活化分子(SLAM)相结合诱发特异性的中和免疫反应[6]。PPRV的H蛋白具有血凝素活性[7]和神经氨酸酶活性[8]。通过构象序列结合，H蛋白的鼠单克隆抗体(mAbs)能识别并中和抗原表位来抑制神经氨酸酶的活性和血凝素的活性[9]。基于H蛋白的PPRV-mAb的检测方法可用于血清学鉴别诊断。

相比较而言，F蛋白是病毒蛋白中最保守的蛋白。在PPRV中，F蛋白是主要的交叉保护性抗原，其C端和N端都具有保守性[4]。由于F基因的高度同源性，它主要用于PPRV的分子流行病学研究[10-11]。

麻疹病毒属病毒的N蛋白具有较高的抗原保守性。N蛋白位于病毒的核心部位，含量高，具有高度免疫原性。PPRV N蛋白的氨基酸序列分为中度保守的氨基端，高度保守的中心区以及覆盖105个aa的极不保守的羧基端3个区域。PPRV N蛋白抗原表位可以通过mAbs检测，还可通过免疫或感染牛羊的阳性血清加以确认[12]。研究发现，N蛋白的单克隆抗体可以区分PPRV和RPV，可用于PPRV ELISA检测试剂盒的研发。

4 血清学检测方法

目前主要用血清学检测结合临床症状及流行病学来确诊PPR。临床上PPR易同出血性败血症(Hemorrhagic septicemia)、山羊传染性胸膜肺炎(Goat contagious pleural pneumonia,CCPP)及RP混淆。PPRV血清学检测方法最常用的是病毒中和试验(VNT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)，较少应用的是血凝抑制试验(HI)和间接免疫荧光试验(IFA)方法。

4.1 血凝抑制试验(HI)和间接免疫荧光试验(IFA) HI是一种便捷廉价的血清学检测手段，但由于其易与麻疹病毒属的其他病毒产生交叉反应而少有应用。IFA是一种将抗原抗体反应与显微示踪相结合的技术，利用血清和相应的荧光标记物孵育，在荧光显微镜下，可以直接观察特异性荧光及其存在的位置。由于该方法需要特殊的仪器设备，仅限于实验室检验。

4.2 病毒中和试验(VNT) VNT是最早用的检测PPRV抗体的血清学方法，也是OIE陆生动物手册中推荐的国际贸易检测方法[13]。VNT是利用抗体对病毒的中和作用，通过观察中和反应后血清与病毒混合液引起的细胞病变来测定血清中的抗体及其效价。该方法最早应用于牛瘟，在牛瘟根除计划[14]中发挥了重要作用。但该方法过于繁琐且需要培养病毒和细胞，不适用于大规模监测。目前该方法作为鉴别手段仅用于实验室的研究，也用于评估新的检测方法及对未知种群、骆驼、易感PPRV野生物种的灵敏度和特异性。

4.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 目前建立的PPRV的ELISA检测方法主要分为间接ELISA法、阻断ELISA法及竞争ELISA法。随着杆状病毒表达系统和原核表达系统的发展，ELISA包被的抗原由原来的全病毒发展为重组蛋白、合成肽等。

4.3.1 间接ELISA法 间接ELISA法是先包被抗原，加入待检血清，利用酶标记的抗抗体检测与固相抗原结合的待检血清。2007年Balamurugan[3]等建立了PPRV的间接ELISA法，包被抗原为PPRV全病毒。现在间接ELISA法使用的抗原多为由杆状病毒表达或原核表达的重组PPRV N蛋白，相较于病毒而言，重组蛋白更易制备、更特异、更安全，无PPRV感染的国家也可以应用[15]。间接ELISA法操作简便，但该检测方法难以区分麻疹病毒属病毒交叉反应，因此常用于初步筛查试验。

4.3.2 阻断ELISA法与竞争ELISA法 阻断ELISA法和竞争ELISA法都是先包被抗原，检测待检血清中的抗体。阻断ELISA法原理是先将待检血清同包被的抗原进行孵育，然后加入H蛋白特异性单克隆抗体，待检血清阻断H蛋白与H蛋白的单克隆抗体结合，导致加入酶标抗二抗的抗体和显色液后阳性血清颜色减退。竞争ELISA法是将待检血清和特异性单克隆抗体同时加入反应板，待检血清与H蛋白特异性单克隆抗体竞相结合包被的抗原，导致加入的酶标抗二抗的抗体和显色液后阳性血清颜色较浅。和竞争ELISA法相比，阻断ELISA法敏感性和特异性更好。竞争ELISA法应用广泛在非洲、中东和亚洲的PPR诊断中，准确性非常高，目前被英国BDSL公司商品化。有研究显示，相对于高度特异的牛瘟竞争ELISA，PPR竞争ELISA法有时会检出牛瘟抗体，尤其是检测牛瘟免疫后的动物时，PPR竞争ELISA法的特异性会明显下降[16]。

4.3.3 基于多肽或抗原表位的ELISA法 虽然竞争ELISA法应用广泛，但由于位阻现象，与牛瘟有一定的交叉反应[16]。为了研发更特异的血清学检测方法，首先要识别具有免疫显性且针对PPRV的抗原表位和结构域，合成单一的抗原表位。短合成肽的优势是它能消除非特异性反应或位阻现象更特异。此外，这种方法还无需培养病毒或制备单克隆抗体。由于在所有结构蛋白中，N蛋白是病毒丰度最高的蛋白，可迅速引起机体产生抗N的免疫应答，因此N蛋白的氨基酸序列被选为PPRV的特异抗原表位的代表。对N蛋白的晶体结构进行分析，显示PPRV N蛋白的多变区具有高免疫原性。比较N蛋白多变区肽段和山羊抗PPR血清以及兔抗牛瘟血清这两者的反应，能快速精准地辨识出针对PPR的抗原表位。Dechamma[17]等的研究显示，N末端区域的肽132STEGPSSGSKKRIN144、C末端区域的肽433ATREEVKAAIP443和454RSGKPRGETPGQLLPEIMQ472与PPRV 抗体的高度特异反应，且与牛瘟血清的反应较少。为进一步提高PPRV竞争ELISA反应的特异性，研究者们致力于通过PPRV N蛋白抗原表位的免疫原性和特异性来制造多克隆抗血清以取代肽基ELISA的单克隆抗体。改进后的基于抗原表位的竞争ELISA(peptide-based ELISA)更加敏感和特异[18]。

4.4 PPRV标记疫苗配和血清学检测的方法 目前现有的检测方法并不能区分免疫动物和感染动物。因此，建立PPRV标记疫苗和配套检测方法将有助于制定免疫策略，控制疫病的流行。最理想的情况是，血清学监测可以鉴别和区分野毒感染的动物、免疫动物以及野毒和免疫共同感染的动物。Buczkowski[19]利用反向遗传技术构建了第一个RPV H蛋白单表位缺失的负标记疫苗，能有效区分接种动物与感染动物，为研发PPRV标记疫苗奠定了良好的基础。PPRV标记疫苗和配套检测方法将成为无疫国家或地区防控突发PPR的理想工具，并且将成为比扑杀政策更经济适用的方法。此外，标记疫苗将降低监测成本并加快疫病控制和根除。

5 小结

竞争ELISA法是准确、标准和高效的检测方法，可评估因感染或注射疫苗引起的免疫反应。因传统的VNT受试验条件所限，竞争ELISA检测方法有望成为VNT的替代检测方法。针对单一表位的单克隆抗体技术的应用显著提高了竞争ELISA法诊断的特异性。该方法可用于检测所有流行国家和无疫国家的小反刍兽样本。虽然还未证实野生动物是PPRV的储存宿主，但已证实它们可以通过家养动物受到感染[20]，利用准确的血清学检测方法对野生动物的PPR进行监测，掌握其流行状态与该疫病的防控息息相关。

近年来，人们逐渐认识了PPR的破坏性及其对国家经济、食品安全带来的巨大影响，国际组织开始重视该病。PPR的危害性迫使我们必须尽快开展全球范围的防控和根除计划。快速准确的血清学诊断是疫情暴发时的首要举措，也是防止疫病进入国门的必要手段。

表1 ELISA方法

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S816

A

0529-6005(2017)09-0065-04

2017-06-07

国家重点研发计划(2016YFC1201603)；十二五国家科技支撑计划(2013BAD12B01)；国家自然科学基金青年科学基金项目(31402171)

刘丹丹(1982-)，女，硕士，从事动物检疫工作，E-mail: ken0439@163.com

杜方原(1990-)，女，硕士，从事动物检疫工作，E-mail:dufy@caiq.gov.cn

注：杜方原与刘丹丹对本文具有同等贡献

吴绍强，E-mail:wusq@caiq.gov.cn;林祥梅，E-mail:linxm@caiq.gov.cn