牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

王 羽 ， 董文龙 ， 王 巍 ， 张喜庆 ， 田佳琪 ， 马红霞 ， 高云航

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118)

牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

王 羽 ， 董文龙 ， 王 巍 ， 张喜庆 ， 田佳琪 ， 马红霞 ， 高云航

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118)

为了确定12株牛源多杀性巴氏杆菌的血清型及毒力基因的携带情况，本研究采用PCR技术对12株牛源多杀性巴氏杆菌(pasteurella maltocida,Pm)进行荚膜血清型鉴定和6种毒力基因(tbpA、hgbA、hgbB、ptfA、pfhA、toxA)的检测，并对其序列进行比对分析。结果显示：12株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型；100%的荚膜血清A型Pm携带hgbA毒力基因和pfhA毒力基因；41.67%的荚膜血清A型Pm携带nanH毒力基因；58.33%的荚膜血清A型Pm携带ptfA毒力基因；而对于tbpA与toxA两种毒力基因在12株牛源荚膜血清A型Pm中均未检测到。

多杀性巴氏杆菌 ； 荚膜血清型 ； 毒力基因

多杀性巴氏杆菌是重要的畜禽致病菌，可引起多种动物出现巴氏杆菌病。根据菌株间抗原差异，多杀性巴氏杆菌可分为多个血清型。根据被动血凝试验对荚膜抗原(K抗原)可分为A、B、D、E和F 5个血清型，用凝集反应对菌体抗原(O抗原)分类，可分为12个血清型，用琼脂扩散试验对热浸出菌体抗原分类可分为16个血清型[1]。多杀性巴氏杆菌血清型与致病性存在一定的相关性，如A型可以引起禽霍乱、猪肺疫；B型可以引起牛和猪等动物的败血症；D和E型可以引起猪、牛、兔、羊等动物的肺炎和败血症；F型主要发生于火鸡，其致病作用目前尚不清楚[2]。同时相关试验已广泛证实，Pm的荚膜在抗吞噬作用中也起着重要作用，且菌体抗吞噬作用的敏感性与荚膜的存在及厚度有关[3]。各血清型多杀性巴氏杆菌的流行性存在较大差异，具有明显的地方特性，故相同血清型不同地方分离的菌株毒力可能不同[1，4]。

Faham Khamesipour等从333头健康及患病牛体内分离了30株多杀性巴氏杆菌，并进行了荚膜基因及23个毒力相关基因的检测，23株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌，56.5%菌株携带pfhA基因，78.3%菌株携带tbpA和nanH基因，ptfA及nanH基因携带率为82.6%，87.0%菌株携带hgbA基因，hgbB基因携带率高达100%，但只有13.0%菌株携带toxA基因[5]。本研究对从吉林省不同地区分离得到的牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的毒力基因进行检测，为客观评估牛巴氏杆菌病的危害提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种 经分离并鉴定的12株牛源多杀性巴氏杆菌保存于吉林农业大学动物科学技术学院预防兽医学研究室。

1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；胎牛血清，购自北京元亨圣马生物技术研究所；ExTaq酶、dNTPs、DNA Marker 2 000、6×ExBuffer等，购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒等，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 致病性试验 将分离纯化的菌株接种到TSA培养基(含50 mL//L 胎牛血清)，37 ℃培养24 h。并进行扩菌培养，并将菌液按10倍系数倍比稀释。随机将小鼠分为13组，每组5只。试验组每只注射0.3 mL 多杀性巴氏杆菌，对照组每只小鼠接种0.3 mL 生理盐水。观察并记录各组小鼠的发病及死亡情况，以寇氏改良法计算半数致死量(LD50) ， 同时采集死亡小鼠的肝脏、心脏进行细菌的分离鉴定。

1.4 PCR鉴定 参考Laxmi Narayan Sarangi[5]等报道的多杀性巴氏杆菌荚膜血清型基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD(如表1)和毒力基因tbpA、hgbA、hgbB、ptfA、pfhA、toxA设计引物(如表2)，并送往(上海)生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 荚膜血清型基因引物序列及预计大小

表2 毒力基因引物序列及预计大小

1.5 DNA提取及毒力基因扩增 挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中(含50 mL//L 胎牛血清)，置于37 ℃水平摇床(170 r/min)增菌培养。取1.6 mL菌液12 000 r/min离心，弃上清，运用酚-氯仿法提取分离菌株DNA。

以提取的DNA为模板，对荚膜血清型和毒力基因进行扩增。PCR扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；退火(退火温度如表1、2)45 s；72 ℃ 45 s；30个循环；72 ℃延伸10min；4 ℃保存。随后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。对PCR产物进行胶回收纯化，将纯化的PCR产物和pMD-18T连接过夜，将连接产物转化到E.coli.DH5α 感受态细胞，按照试剂盒提取质粒进行验证，并送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2 结果

2.1 致病性试验结果 12株多杀性巴氏杆菌的LD50分别为6.29×105CFU/mL，2.1×103CFU/mL，3.5×105CFU/mL，7.1×108CFU/mL，4.32×105CFU/mL，1.23×104CFU/mL，2.9×105CFU/mL，6.78×105CFU/mL，1.42×104CFU/mL，9.3×105CFU/mL，1.9×106CFU/mL，4.5×105CFU/mL 。剖检病死小鼠，观察病变，并进行细菌分离及分子生物学鉴定，确定为多杀性巴氏杆菌。

2.2 荚膜血清型PCR扩增结果 以基因组DNA为模板，采用PCR技术对12株Pm进行荚膜型基因进行扩增，均扩增出1 000 bp大小左右的片段。扩增序列与GenBank上已公布的荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC多杀性巴氏杆菌(AY225345.1)序列同源性达到99%，据此可鉴定该菌为A型多杀性巴氏杆菌。hyaD-hyaC基因扩增结果如图1。

图1 hyaD-hyaC 基因扩增结果M:DL-2 000 Marker; Pm-1—Pm-2:多杀性巴氏杆菌

2.3 毒力基因扩增结果

2.3.1hgbA基因PCR扩增及序列检测结果 10株菌扩增出约700 bp的片段，与预期片段大小相符，根据BLAST对比结果可知，菌株Pm-1、Pm-3、Pm-5、Pm-6、Pm-7、Pm-9、Pm-11扩增序列与GenBank上已公布的Pm毒力基因hgbA(登录号AF237923.1)同源性为100%，Pm-2、Pm-4、Pm-8、Pm-10、Pm-12扩增序列与登录号AF237923.1同源性为99%。hgbA基因扩增结果如图2。

图2 hgbA 基因扩增结果M:DL-2 000 Marker; Pm-1—Pm-2:多杀性巴氏杆菌

2.3.2nanH基因PCR扩增及序列检测结果 菌株Pm-1、Pm-3、Pm-7、Pm-11、 Pm-12株Pm均扩增出900 bp左右的片段，该基因片段测序后使用BLAST对其碱基序列进行分析，其结果显示，所扩增的nanH相应序列与GenBank上已公布的Pm毒力基因nanH(登录号AF274869.1)序列同源性为95%。nanH基因扩增结果如图3。

图3 nanH基因扩增结果M:DL-2 000 Marker; Pm-1—Pm-2:多杀性巴氏杆菌

2.3.3pfhA基因PCR扩增及序列检测结果 12株Pm均扩增出800 bp左右的片段，根据BLAST对比结果可知，菌株Pm-1、Pm-2、Pm-4、Pm-5、Pm-10、Pm-12与GenBank上已公布的Pm毒力基因pfhA(登录号AF237929.1)同源性为100%，Pm-3、Pm-6、Pm-7、Pm-8、Pm-9、Pm-11与登录号AF237929.1同源性为99%。12株Pm的pfhA基因扩增结果如图4。

图4 pfhA基因扩增结果M:DL-2 000 Marker;Pm-1—Pm-2:多杀性巴氏杆菌

2.3.4ptfA基因PCR扩增及序列检测结果 菌株Pm-1、Pm-2、Pm-4、Pm-5、Pm-9、Pm-10、Pm-11均扩增出约400 bp左右大小的片段，进行BLAST分析，其结果显示7株菌扩增序列与GenBank上已公布的Pm毒力基因ptfA(登录号KP726888.1)同源性均为100%。ptfA基因扩增结果如图5。

图5 ptfA基因扩增结果M:DL-2 000 Marker;Pm-1—Pm-2:多杀性巴氏杆菌

2.3.5tbpA基因及toxA基因PCR扩增结果 以基因组DNA为模板，采用PCR技术对tbpA基因与toxA基因进行扩增，均未检测到。

3 讨论

多杀性巴氏杆菌是一种有荚膜的革兰阴性杆菌，由于荚膜血清型决定病原菌的免疫原性，各血清型之间交叉免疫保护性较低，对该致病菌进行荚膜分型就显得尤为重要[6]。1984 年Carter G R 等[7]提出多杀性巴氏杆菌血清型的标准定名，分为A、B、D、E 和F 5 个荚膜血清型。近年来在牛群中流行的主要是以引起肺部感染为主的荚膜血清A型巴氏杆菌[8]。本研究对在不同地区分离到12株多杀性巴氏杆菌进行血清分型，12株菌均为荚膜A型。

自从1959年世界卫生组织(WHO)将巴氏杆菌病定为一类重要动物传染病，Pm就一直受到各国学者的关注[9]。在本研究中对6种毒力基因的检测结果显示,12株牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌均扩增出pfhA基因和基因hgbA，菌株Pm-1、Pm-2、Pm-4、Pm-5、Pm-9、Pm-10、Pm-11含有基因ptfA，菌株Pm-1、Pm-3、Pm-7、Pm-11和Pm-12含有nanH基因。12株菌株均未扩增出toxA和tbpA基因。菌株Pm-1、Pm-2、Pm-4、Pm-9有相同的毒力基因，动物试验结果表明不同菌株间其毒力存在一定差异，菌株2毒力最强，菌株4毒力最弱。通过本试验可得出两种推断:(1)菌株2和4毒力差异可能与基因表达程度以及调控不同而造成;(2)可能还有其他基因参与。毒力因子之间的相互作用还有待于进一步研究。

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CapsularSerotypeandVirulenceGeneDetectiononBovineSourcePasteurellamultocida

WANG Yu , DONG Wen-long , WANG Wei , ZHANG Xi-qing , TIAN Jia-qi , MA Hong-xia , GAO Yun-hang

(College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China)

To determine the serotype and virulence genes of 12 strains ofPasteurellamultocida. We use PCR technology for detection and sequence analysis of 12 Bovine sourcePasteurellamultocida(Pm)of capsular serotype and 6 virulence genes (ptfA,pfhA,hgbA,hgbB,tbpA,toxA).The results showed that all 12Pmstrains are capsular serotype A, 100% of the bovine source capsular serotype APmstrains carry virulence genespfhAand virulence genes hgbA；41.67% of bovine source capsular serotype APmstrains carry virulence genes nanH; 58.33% of bovine source capsular serotype APmstrains carry virulence genes ptfA; tbpA and toxA was not detected in 12 bovine source capsular serotype APmstrains.

Pasteurella multocida; capsular serotype;virulence genes

GAO Yun-hang

S852.65+3 文献杯志码：A

0529-6005(2017)09-0016-04

2017-03-12

王羽(1993-)，女，硕士生，研究方向为动物疫病防治，E-mail：1846020084@qq.com

高云航，E-mail：gaoyunhang@163.com