中药复方对小鼠免疫功能的影响

曹礼静 ， 袁丽花 ， 廖开燕

(1.重庆市荣昌区职业教育中心 ， 重庆 荣昌 402460 ； 2.重庆市荣昌初级中学，重庆 荣昌 402460)

中药复方对小鼠免疫功能的影响

曹礼静1， 袁丽花1， 廖开燕2

(1.重庆市荣昌区职业教育中心 ， 重庆 荣昌 402460 ； 2.重庆市荣昌初级中学，重庆 荣昌 402460)

为了筛选能够提高免疫抑制小鼠免疫水平的中药复方。本试验采用环磷酰胺人工建立小鼠免疫低下模型。将造模成功的小鼠随机分为中药复方高、中、低剂量组(40 g/kg体重、20 g/kg体重、10 g/kg体重)，模型组，阳性药物组，设置空白对照组。检测各组小鼠免疫器官指数、血清溶血素水平、腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清中免疫球蛋白IgG、IgM含量。结果显示：与模型组比较，复方中、低剂量组小鼠体重增长数较高，脾脏指数显著性升高(P<0.05)；复方高、中、低剂量组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率、吞噬指数均显著性升高(P<0.05)；复方中剂量组小鼠血清溶血素含量、血清中IgG、IgM含量极显著性升高(P<0.01)。结果表明，中药复方中剂量组能有效拮抗环磷酰胺的免疫抑制作用，提高免疫抑制小鼠的免疫功能。

小鼠 ； 免疫力 ； 中药复方

机体的免疫水平直接影响着动物的抗病力与生产力。在养殖生产中，如何通过增强动物的抵抗力从而降低其发病率，提高生产效益的问题己受到畜牧行业专家与养殖生产者越来越多的关注。前人研究发现，许多中药中的糖类、有机酸类、生物碱类、苷类和挥发油类等，均有增强免疫的作用[1]。大多数滋补强壮类和部分祛邪类中药也能提高机体免疫水平，对非特异性免疫、特异性免疫均有促进作用，部分补益类中药如枸杞，还具有免疫增强或抑制的双向调节作用[2]。中药毒副作用小、使用安全、不易产生耐药性、无有害残留，既可杀菌又能增强动物机体的免疫力等优点，在规模化养殖中受到越来越多的重视，因此研究具有增强机体免疫功能的中药复方具有广泛的应用前景。

本试验选用黄芪、当归、白术、甘草、大枣、苦参、金银花、鱼腥草等组成中药复方来改善免疫抑制小鼠的免疫功能，以探讨该中药复方对免疫抑制小鼠免疫功能的调控作用及机制。

1 材料与方法

1.1 中药及试剂 黄芪、当归、白术、甘草、大枣、苦参、金银花、鱼腥草；Mouse IgG ELISA kit，Mouse IgM ELISA kit试剂盒。

1.2 药液的制备 按要求称取药材，粉碎并过12目筛，加入药材总重量6.5倍量的水浸泡1.0 h，每次煎煮1.0 h，共煎煮3次，过滤并收集滤液，95 ℃～100 ℃下蒸发浓缩滤液至浓度为1.0 g/mL，即得所需药液。

1.3 试验动物 体重18～22 g昆明系小鼠90只，雌雄各半，购自西南大学荣昌校区动物科。

1.4 试验方法

1.4.1 小鼠免疫抑制模型的建立[3-4]用无菌水配制浓度为10 mg/mL环磷酰胺溶液(CY)，4 ℃保存备用。取70 只健康小鼠，雌雄各半，腹腔注射CY(每次100 mg/kg体重)，1次/d，连用3 d，构建小鼠免疫抑制模型。另取20只小鼠为健康对照，腹腔注射生理盐水(0.2 mL/10 g体重)。与正常组小鼠比较，若造模组小鼠出现严重脱毛、精神不振、食欲明显下降等现象，随机取其中几只小鼠进行解剖检查，若发现脾脏萎缩，肝脏发白，胸腺受损等，则表明免疫低下小鼠模型建立成功。

1.4.2 试验分组与处理[5]将建模成功且体重在18～22 g之间的小鼠随机分为阳性药物组(黄芪多糖，30 mg/kg体重)、中药复方高、中、低剂量组(分别按40 g/kg体重、20 g/kg体重、10 g/kg体重给药)，模型组(生理盐水，0.2 mL/10 g体重)；注射生理盐水的小鼠设为空白对照组(生理盐水，0.2 mL/10 g体重)，每组10只，连续灌胃给药7 d，每天1次。同时每天定时观察并记录小鼠的精神状况、饮食、死亡等临床表现，并于试验前后记录小鼠体重、死亡数等。

1.4.3 免疫器官指数测定 各组小鼠分别于试验结束后称取体重及脾脏、胸腺重量，脏器重量比上体重分别计算各组每只小鼠脾脏及胸腺指数。

1.4.4 血清溶血素的测定 参照文献[6]的方法，在给药第3天时，各组取5只小鼠腹腔注射5% 鸡红细胞悬液0.2 mL，连续5 d，末次给药24 h后，称取各组小鼠重量后摘眼球采血，3 500 r/min分离血清，4 ℃冷藏备用。取部分血清加生理盐水稀释100倍，取1 mL稀释好的血清与0.5 mL 5%鸡红细胞悬液和0.5 mL 10%豚鼠补体混匀，同时设置空白对照管。将上述样品放置于37 ℃恒温箱中孵育0.5 h后于4 ℃冰箱终止反应，最后2 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL放置10 min后，以对照管作为空白调零，于540 nm处测样品A值。

稀释倍数

1.4.5 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定[7]每组剩余的5只小鼠于给药7 d 后称重，在腹腔注射0.5 mL 5%鸡红细胞后8 h处死，腹腔注入2 mL PBS(缓冲液)，轻揉腹部1 min，用注射器抽取0.5 mL腹腔液滴体于载玻片上，37 ℃ 孵育30 min，用甲醇固定5 min后进行Giemsa染色，每张涂片计数200个巨噬细胞，按以下公式计算各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数。

1.4.6 中药复方对免疫抑制小鼠血清中IgG、IgM含量的影响 取1.4.4中分离所得血清用ELISA法测定其中IgG、IgM的含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。最后用全自动酶标仪在450 nm波长处测定吸光度(OD值)。

2 试验结果

2.1 小鼠免疫抑制模型的建立 与空白组比较观察发现：腹腔注射环磷酰胺组小鼠表现精神不振、被毛逆立、脱毛、食欲下降、体重减轻等现象；随机抽取其中几只小鼠进行解剖检查发现：小鼠胸腺、脾脏出现萎缩，肝脏发白等，表明免疫功能低下小鼠模型造模成功。

2.2 临床表现及死亡率 给药前，与空白组比较，其他试验组小鼠均出现精神不振、被毛逆立、脱毛、食欲下降等临床症状。给药第4天发现，复方中剂量组小鼠较其他给药组小鼠精神好转，活动量增加，被毛光滑，无掉毛，食欲开始恢复等现象。与给药组比较，模型组小鼠精神较沉郁，聚堆，被毛逆立，掉毛现象严重，食欲减退。据图1可知：空白组、阳性药物组、复方高、中剂量组小鼠死亡率均低于模型组小鼠死亡率；据图2可知：试验期间，各试验组小鼠体重均增加，与模型组比较，复方中、低剂量组体重增长数较高。

2.3 免疫器官指数测定 由表1可知，各试验组小鼠胸腺指数均无显著性差异(P>0.05)，无统计学意义；模型组小鼠脾脏指数为2.49，与空白组比较有显著性差异(P<0.05)；与模型组比较，复方中、低剂量组小鼠脾脏指数分别为2.90、5.55， 呈显著性升高(P<0.05)。

图1 各试验组小鼠死亡率

图2 各试验组小鼠体重变化

表1 中药复方对免疫功能低下小鼠胸腺及脾脏指数的影响

注：同一列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05) ；同一列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),下表同

2.4 血清溶血素的测定 由表2可知，与模型组相比复方中剂量组小鼠血清溶血素含量极显著性升高(P<0.01)，与空白组比较没有显著性差异(P>0.05)。

表2 中药复方对免疫功能低下小鼠血清溶血素的影响

2.5 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定 由表3可知，模型组小鼠吞噬率、吞噬指数分别为15.67、0.19，与空白组比较具有显著性差异(P<0.05)；与模型组比较，复方高、中、低剂量组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率、吞噬指数均显著升高(P<0.05)。

表3 中药复方对免疫功能低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数的影响

2.6 小鼠血清免疫球蛋白IgM、IgG含量的测定 图3、图5为小鼠血清IgM、IgG含量测定的标准曲线图，通过标准曲线可计算各组小鼠血清免疫球蛋白的含量。由图4可知：与空白组比较，模型组小鼠血清IgM含量极显著性降低(P<0.000 1)；与模型组比较，复方高、低剂量组血清中IgM含量升高，有极显著性差异(P<0.01)，复方中剂量组血清中IgM含量升高，有极显著性差异(P<0.000 1)。由图6可知：与空白组比较，模型组小鼠血清IgG含量极显著性降低(P<0.000 1)；与模型组比较，复方中剂量组血清中IgG含量升高，有极显著性差异(P<0.000 1)。

3 分析与讨论

大部分中药具有双向免疫调节作用，可使动物的免疫水平恢复正常，其体现了中兽医理论的“整体观念”与“ 阴阳平衡”理论，机体的免疫功能就是机体的抗病防病能力，属于中兽医学“正气”的范畴。机体正气旺盛时，防病抗病能力增强，即“正气存内、邪不可干”；机体正气低下时，防病抗病能力日益下降，邪气攻其不备，即“邪之所凑，其气必虚”[8]。本试验所用中药复方由黄芪、当归、白术、甘草、大枣、苦参、金银花、鱼腥草等组成，据现代药理学研究表明，黄芪多糖、苦参碱、白术多糖、当归多糖对机体的特异性及非特异性免疫功能均有一定的调节作用，所以诸药合用可调节机体的免疫力。

在免疫调节药物的研究中，环磷酰胺对多种癌细胞均有杀伤作用，但对细胞的选择性不高，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤机体正常细胞，最终导致动物机体免疫能力的下降[8]。所以本文采用环磷酰胺来制备小鼠免疫功能低下模型。根据文献[6、9-10]进行预试验，发现当注射量为100 mg/kg体重，注射2次后，小鼠出现精神不振、被毛逆立、脱毛、食欲下降、体重下降等症状，随机抽取其中小鼠进行解剖检查发现：小鼠胸腺、脾脏萎缩，肝脏发白等，证明造模成功。免疫器官是免疫细胞产生、发育、成熟及机体发挥免疫作用的主要场所，其生长发育情况直接影响到机体的免疫功能，在一定程度上其指数的大小可清楚地反映机体的非特异性免疫能力[11]，所以常采用测定小鼠免疫脏器指数来评价免疫力的强弱。本试验中复方中、低剂量组小鼠脾脏指数和模型组比较显著性升高(P<0.05)，而胸腺指数没有显著性变化。说明试验所选中药复方提取液对免疫抑制小鼠脾脏指数有明显的提升作用，提示该中药复方可能对被破坏的脾脏细胞与组织有修复作用，从而提高机体的免疫功能。

图3 小鼠血清IgM含量测定标准曲线

图4 小鼠血清IgM含量测定

图5 小鼠血清IgG含量测定标准曲线

图6 小鼠血清IgG含量测定

(注：与空白对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.000 1；与模型组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.0001)

巨噬细胞是动物机体主要的免疫细胞之一，本试验利用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和消化鸡红细胞数量的试验观察到，复方高、中、低剂量组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数较模型组均显著性升高，说明试验所选中药复方可通过增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力来加强小鼠的非特异性免疫的功能，可能是复方中的当归发挥了相应的作用。

血清溶血素的测定可以计算出血清中的抗体含量，OD值越大，抗体含量越高，说明机体的体液免疫功能越强[12]。本试验中采用鸡红细胞腹腔注射小鼠，试验结果表明，中药复方中剂量组小鼠血清溶血素含量极显著性高于模型组，与文献报道一致，说明所筛选的中药复方当以中剂量灌胃试验小鼠时可促进小鼠机体溶血素抗体的生成，从而提高小鼠体液免疫功能。

免疫细胞产生的免疫球蛋白是免疫细胞相互作用的重要信号及物质基础，在机体免疫过程中发挥着不可或缺的作用。本试验中与模型组比较，复方中剂量组血清中IgG、IgM含量均极显著升高，说明该中药复方可通过增加血清中IgG、IgM含量来提高机体的免疫水平。

综上所述，试验中药复方当以20 g/kg体重灌胃小鼠时可通过增加小鼠脾脏指数，增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力、机体血清溶血素水平和提高血清中免疫球蛋白含量来增强小鼠的免疫力。

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EffectofChineseherbalmedicinecompoundontheimmunefuctionofmice

CAO Li-jing1， YUAN Li-hua1， LIAO Kai-yan2

(1.Rongchang Vocational Education Center of Chongqing，Rongchang ，Chongqing 402460，China 2.Rongchang junior school of Chongqing，Rongchang，Chongqing 402460，China)

In order to screen out the traditional Chinese medicine compounds which can improve the immunity level of immunosuppressive mice, models were established artificially with cyclophosphamide. After the mouse models were established, mice with similar weight were randomly divided into five groups, including Chinese medicine compound high dose，medium dose and low dose(the immunosuppressive mice were treated with 40g/kg, 20g/kg and 10g/kg traditional Chinese medicine compound,repectively)， immunodepression model group, positive group，and blank control group. In this study, the indexes of thymus and spleen, peritoneal macrophage phagocytic function, serum hemolysin content and serum levels of IgG，and IgM in mice were analyzed. The results showed that when compared with model group, the body weight of mice was higher, the spleen index significantly increased(P<0.05) in the compound low and high dose groups.The peritoneal macrophage phagocytic rate and phagocytic index were significantly higher (P<0.05) of compound high, medium and low dose groups; the levels of serum hemolysin content and serum IgG，and IgM were significantly increased (P<0.01) of Chinese medicine compound medium dose group. It is concluded that the middle dose group of Chinese medicine could effectively inhibit the immunosuppressive effect of cyclophosphamide and improve the immune function of immunosuppressed mice.

Mice ； Immunity ； Chinese herbal medicine compound

S853.72

A

0529-6005(2017)09-0058-04

2017-02-17

曹礼静(1972-)，男，中专研究员，硕士，主要从事中职畜牧兽医教学研究及教育管理研究，E-maiL：caoLij888@126.com