人脑胶质瘤中ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg的表达及免疫调节机制

呼铁民 齐宝柱 田 甜 杨国军 王昆鹏 周敬君 季东鑫 王维兴

(承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

1 秦皇岛市青龙满族自治县医院 2 承德市第六医院

人脑胶质瘤中ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg的表达及免疫调节机制

呼铁民 齐宝柱 田 甜 杨国军 王昆鹏 周敬君1季东鑫2王维兴

(承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

目的探讨人脑胶质瘤中解聚素-金属蛋白酶(ADAM)17、表皮生长因子受体(EGFR)和CD4+CD25+Treg的表达及免疫调节机制。方法选取人脑胶质瘤标本52例，其中Ⅰ～Ⅱ级(低度恶性胶质瘤)19例，Ⅲ～Ⅳ级(高度恶性胶质瘤)33例；另取10例因颅脑损伤行手术治疗切取的正常脑组织标本为对照组。免疫组化染色观察标本组织中ADAM17、EGFR蛋白阳性表达情况；Western印迹和RT-PCR检测其中ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表达量；流式细胞术检测CD4+CD25+Treg细胞比率。结果胶质瘤组织中ADAM17蛋白阳性表达率明显高于正常脑组织(P<0.01)；高度恶性组织明显高于低度恶性组织(P<0.05)。脑胶质瘤组织ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表达量明显高于正常脑组织；高度恶性脑组织表达量明显高于低度恶性脑组织(P<0.01)。脑胶质瘤组织CD4+CD25+Treg细胞比率明显高于正常脑组织，且随恶性程度增加而升高(P<0.01)。脑胶质瘤组织中ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表达水平均与CD4+CD25+Treg细胞比率呈正相关(P<0.05)。结论ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg在人脑胶质瘤中高表达且与病理分级相关；ADAM17、EGFR可能通过诱发CD4+CD25+Treg的负性免疫调节而减弱免疫监视，促进胶质瘤的发生、发展。

人脑胶质瘤；表皮生长因子受体解聚素-金属蛋白酶(ADAM17)；表皮生长因子受体(EGFR)；免疫调节

解聚素-金属蛋白酶(ADAM)17属于细胞膜表面糖蛋白，具有蛋白剪切作用，可发挥多种生物活性〔1〕。表皮生长因子受体(EGFR)属于多功能跨膜糖蛋白，已被证实在神经系统中发挥神经诱向作用〔2〕。因ADAM17、EGFR在胃癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中均发挥作用，逐渐受到该领域学者的重视。相关研究显示，ADAM17、EGFR蛋白可作为经典CD4+CD25+Treg的特异性表面标志，而CD4+CD25+Treg属于调节性T细胞，在肿瘤免疫耐受中具有重要作用〔3〕。目前关于ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg在人脑胶质瘤方面的研究鲜有报道，本研究旨在检测上述三者在人脑胶质瘤和正常脑组织中的表达及其在脑胶质瘤发生中的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2016年10月在承德医学院附属医院神经外科手术切除并经病理证实的人脑胶质瘤标本52例，其中男29例，女23例，年龄57～75岁，平均(66.35±4.18)岁。按世界卫生组织2007年颁发的中枢神经系统肿瘤分级标准：Ⅰ～Ⅱ级(低度恶性胶质瘤)19例，Ⅲ～Ⅳ级(高度恶性胶质瘤)33例。另取同年龄段10例因颅脑损伤行手术治疗切取的正常脑组织标本为对照组。

1.2材料与设备 兔抗人ADAM17多克隆抗体、鼠抗人EGFR单克隆抗体购于上海康朗生物科技有限公司；Per CP标记的CD4抗体、FTTC标记的CD25抗体购于北京泰泽瑞达科技有限公司；RT-PCR试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司，引物由上海合星生物科技有限公司合成；全自动组织处理器由德国美天旎生物技术公司生产；流式细胞仪由德国Partec生产。

1.3方法

1.3.1免疫组化检测 将标本组织切片常规脱蜡、水化，放入3% 双氧水中孵育15 min，放入枸橼酸缓冲液中加热10 min修复抗原，10%山羊血清封闭30 min；滴加10%封闭液稀释的ADAM17、EGFR多克隆抗体100 μl(1∶200稀释)，阴性对照用磷酸缓冲液代替一抗，4℃孵育过夜；滴加HRP标记的二抗，室温下放置40 min，加入链酶亲和素-生物素-过氧化物酶，孵育40 min，DAB显色，苏木精复染。光学显微镜下观察棕黄色颗粒为ADAM17和EGFR蛋白阳性表达，根据阳性细胞比例和染色强度分级：无阳性细胞计0分、阳性细胞<30%计1分、30%～70%计2分、>70%计3分；染色为浅黄色计1分、黄色计2分、棕黄色计3分；两者综合评分：0分为阴性、1～2分为弱阳性、3～4分为阳性、5～6分为强阳性。

1.3.2Western印迹检测 胶质瘤组织标本放入EP管中，加入组织裂解液，4℃ 10 000 r/min离心20 min，取上清，BCA法蛋白定量，吸取100 μg总蛋白，100℃水浴10 min变性后行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将目标细胞蛋白湿法转移至PVDF膜，TBST液洗涤后加一抗：兔抗人ADAM17多克隆抗体(1∶200稀释)、鼠抗人EGFR单克隆抗体(1∶500稀释)，β-actin抗体(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜；加二抗，室温孵育60 min，DAB显色，Image J分析蛋白表达条带的灰度值，以β-actin为内参，计算ADAM17、EGFR蛋白的相对表达量。

1.3.3RT-PCR检测 液氮下研碎胶质瘤组织标本，Trizol法提取RNA，按试剂盒说明进行PCR扩增，反应体系共30 μl：Taq酶15 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物各2 μl，双蒸水10 μl；反应条件：90℃ 10 min、94℃ 5 min、56℃ 40 s、72℃ 1 min，共40个循环。产物行琼脂糖凝胶电泳，扫描检测目标条带，以β-actin为内参计算ADAM17 、EGFR mRNA的相对表达量。

1.3.4流式细胞术检测CD4+CD25+Treg细胞比率 使用全自动组织处理器得到胶质瘤组织单细胞悬液，加入淋巴细胞分离液行梯度离心，收集单个核细胞层；分别加入Per CP标记的CD4抗体、FTTC标记的CD25抗体，4℃暗室孵育60 min，3 000 r/min离心弃上清，磷酸缓冲液洗涤后重悬细胞，滴加二抗，待标记完成后用流式细胞仪分选CD4+CD25+Treg细胞并计数。

1.4统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验和Spearman相关分析。

2 结 果

2.1脑胶质瘤中ADAM17、EGFR蛋白阳性表达情况 ADAM17、EGFR蛋白多阳性表达于细胞质，在正常脑组织中阳性表达率为30.00%(3/10)、40.00%(4/10)，均为弱阳性。脑胶质瘤组织中阳性表达率为86.53%(45/52)、94.23%(49/52)，其中低度恶性组织中阳性表达率为73.68%(14/19)、78.95%(15/19)，主要为阳性表达；高度恶性组织中阳性表达率为93.94%(31/33)、96.97%(32/33)，主要为强阳性表达。胶质瘤组织中ADAM17、EGFR蛋白阳性表达率明显高于正常脑组织(P<0.01)；高度恶性组织明显高于低度恶性组织(P<0.05)。见图1、图2。

图1 不同恶性程度脑胶质瘤中ADAM17蛋白阳性表达情况(×400)

图2 不同恶性程度脑胶质瘤中EGFR蛋白阳性表达情况(×400)

2.2脑胶质瘤中ADAM17、EGFR蛋白表达量 正常脑组织、低度恶性脑组织、高度恶性脑组织中ADAM17蛋白相对表达量分别为(0.17±0.05)、(0.33±0.07)、(0.79±0.16)；EGFR蛋白相对表达量分别为(0.00±0.00)、(0.51±0.10)、(1.21±0.26)。脑胶质瘤组织中ADAM17、EGFR蛋白表达量明显高于正常脑组织；高度恶性脑组织中蛋白表达量明显高于低度恶性脑组织(P<0.01)。见图3。

图3 不同恶性程度脑胶质瘤中ADAM17、EGFR蛋白表达情况

2.3脑胶质瘤中ADAM17、EGFR mRNA表达情况 正常脑组织、低度恶性脑组织、高度恶性脑组织中ADAM17 mRNA相对表达量分别为(0.19±0.01)、(0.65±0.03)、(1.38±0.09)；EGFR mRNA相对表达量分别为(0.01±0.00)、(0.47±0.02)、(1.10±0.06)。脑胶质瘤组织ADAM17、EGFR mRNA相对表达量明显高于正常脑组织；高度恶性脑组织相对表达量明显高于低度恶性脑组织(P<0.01)。

2.4脑胶质瘤中CD4+CD25+Treg细胞比率 正常脑组织、低度恶性脑组织、高度恶性脑组织中CD4+CD25+Treg细胞比率分别为(3.61±0.34)、(6.75±0.18)、(11.37±0.53)；脑胶质瘤组织明显高于正常脑组织，且随恶性程度增加而升高(P<0.01)。

2.5相关性分析 脑胶质瘤组织中ADAM17、EGFR蛋白表达水平与CD4+CD25+Treg细胞比率呈正相关(r=3.614、2.186，P<0.05)；ADAM17、EGFR mRNA表达水平与CD4+CD25+Treg细胞比率呈正相关(r=1.405、1.118，P<0.05)。

3 讨 论

胶质瘤是人脑中的常见肿瘤，放化疗、生物治疗等传统手段的总体预后不理想。近年来，随着对胶质瘤机体免疫耐受机制的进一步研究发现，调节T细胞在病情发展过程中发挥关键作用〔4〕，其中CD4+CD25+Treg不仅能够抑制自身免疫性疾病发生，还参与肿瘤的免疫调节，可有效抑制树突细胞和CTL细胞的功能，抑制肿瘤抗原的呈递与识别，降低机体的细胞免疫力，使肿瘤处于免疫逃避状态〔5〕。同时CD4+CD25+Treg还可对辅助性T细胞(Th)1/ Th2信号通路产生影响，减弱Th对肿瘤细胞的杀伤作用〔6〕。相关研究发现，ADAM17、EGFR蛋白具有神经细胞诱导作用，在神经轴突中可检测到其表达，与神经发育、重塑具有相关性〔7〕。研究发现，ADAM17、EGFR在胃癌、肺癌、乳腺癌等多种癌细胞中均存在高表达，且与病理分级呈正相关，在癌细胞迁移、侵袭中发挥重要作用〔8〕，但目前国内外仍鲜见ADAM17、EGFR蛋白与CD4+CD25+Treg在人脑胶质瘤中的表达及作用研究。近年来研究已经证实脑组织并非免疫豁免器官，如肿瘤发生后会损坏血脑屏障，淋巴细胞进入中枢神经细胞调节免疫功能；星状胶质细胞和小胶质细胞均在颅内发挥免疫监控作用〔9〕。同时胶质瘤的发生、发展及复发与免疫缺陷存在明显关联〔10〕。

ADAM17、EGFR是CD4+CD25+Treg的表面特异性分子，能够诱发其免疫耐受。综合CD4+CD25+Treg在肿瘤微环境中免疫耐受作用，可认为ADAM17、EGFR通过诱发CD4+CD25+Treg的负性免疫调节，使肿瘤细胞脱离机体免疫监视，进而促进胶质瘤的发生、发展。

1Yang Z,Zhao T,Liu Y,etal.Upregulation of tumor suppressor WWOX promotes immune response in glioma〔J〕.Cell immunol,2013;285(1/2):1-5.

2Anirban G,Malabika B,Pallab S,etal.T11 target structure exerts effector function by activating immune cells in CNS against glioma where cytokine modulation provide favorable microenvironment〔J〕.Indian J Exp Biol,2010;48(9):879-88.

3刘英姿.Treg细胞和IL-18在脑胶质瘤中的作用研究〔D〕.石家庄：河北医科大学,2011.

4刘许昌,王 健.老年恶性脑胶质瘤术后替莫唑胺化疗联合放疗的近远期疗效〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(20):5835-6.

5Maes W,van Gool SW.Experimental immunotherapy for malignant glioma:lessons from two decades of research in the GL261 model〔J〕.Cancer Immunol Immunothera,2011;60(2):153-60.

6皇甫罗锴.B7-H1在脑胶质瘤中对Treg细胞的调节作用〔D〕.西安：第四军医大学,2013.

7赵 雪,宋文刚.重组金针菇免疫调节蛋白的纯化及生物活性研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2015;16(2):178-81.

8Xu L,Xiao H,Xu M,etal.Glioma-derived T cell immunoglobulin-and mucin domain-containing molecule-4(TIM4) contributes to tumor tolerance〔J〕.J Biolog Chem,2011;286(42):36694-9.

9许昌海,金红旭.持续性肾脏替代联合血必净对脓毒症患者炎症反应、免疫功能的影响〔J〕.中国卫生工程学,2016;(5):499-500.

10Piotrowska MJ,Bodnar M,Poleszczuk J,etal.Mathematical modelling of immune reaction against gliomas:Sensitivity analysis and influence of delays〔J〕.Nonlinear Anal Real World Appl,2013;14(3):1601-20.

呼铁民(1974-)，男，硕士，副主任医师，主要从事颅内肿瘤及颅内动脉瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-5063-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.049

〔2017-02-03修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)