当羊骨片对维甲酸致骨质疏松大鼠转化生长因子-β1 mRNA表达的影响

尹 鑫 于海龙 张晓峰 杨 丽 王 伟 李青春

(承德医学院中药研究所，河北 承德 067000)

1 航天中心医院

当羊骨片对维甲酸致骨质疏松大鼠转化生长因子-β1 mRNA表达的影响

尹 鑫 于海龙 张晓峰 杨 丽 王 伟1李青春

(承德医学院中药研究所，河北 承德 067000)

目的观察当羊骨片对维甲酸致骨质疏松(OP)大鼠股骨转化生长因子(TGF)-β1 mRNA表达的影响。方法6月龄SPF级雌性SD大鼠60只，随机分为正常对照组、维甲酸模型组、仙灵骨葆组(312 mg/kg)和当羊骨片低、中、高剂量组(250，500，1 000 mg/kg)，每组10只,除正常对照组外，其余各组动物每日灌胃给予维甲酸70 mg/kg，连续14 d。造模的同时，各组给予相应药物干预，共28 d。检测子宫质量指数、血清TGF-β1水平、股骨上段TGF-β1 mRNA表达及胫骨上段骨组织形态学变化。结果与正常对照组比较，维甲酸模型组血清TGF-β1水平、股骨TGF-β1 mRNA表达及子宫质量指数显著降低(P<0.01),形态学检查可见骨髓腔变大，骨小梁变细变薄，排列稀疏、不规则等骨质疏松表现。与维甲酸模型组比较，当羊骨片高剂量组能显著升高血清TGF-β1水平、股骨TGF-β1 mRNA表达及子宫质量指数(P<0.01，P<0.05)，当羊骨片中剂量组与仙灵骨葆组能显著升高股骨TGF-β1 mRNA表达(P<0.01)，而血清TGF-β1水平高于维甲酸模型组，但无显著差异(P>0.05)。结论当羊骨片对TGF-β1基因表达有一定的调控作用，对维甲酸致OP大鼠有一定的防治作用。

骨质疏松；维甲酸；当羊骨片；转化生长因子-β1

骨质疏松(OP)是以骨结构退化、骨量减少、脆性增加、容易病理性骨折为主要特征，属于全身性骨骼老化或退化的代谢障碍性疾病〔1〕，属于中老年退行性疾病，随着社会老龄化的加剧，其发病率已跃居多发病、常见病的第7位，全世界已有超过2亿OP患者〔2，3〕。转化生长因子(TGF)-β1是在骨组织中含量最丰富的生长因子，具有抑制破骨细胞生成而拮抗骨吸收，同时具有促进成骨细胞分化增殖而刺激骨形成的双重作用。本实验观察复方制剂当羊骨片对维甲酸致OP大鼠骨组织TGF-β1基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级6月龄雌性SD大鼠60只，体质量(280±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京) 2012-0001。动物自由饮食饮水，室温(24±2)℃,湿度40%～75%。

1.2药品与试剂 当羊骨片(承德医学院中药研究所提供，规格:0.4 g/片)；仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司，规格:0.5 g/粒，国药准字Z20025337)；维甲酸(北京贝丽莱斯生物化学有限公司，批号:140601)；RT-PCR试剂盒(批号:M3014)、Marker(批号:K0228)、Taq PCR Master Mix(批号:KT201-02)；PCR扩增引物(美国Invitrogen生命技术公司，批号:HB1410170019)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海索宝生物科技有限公司,批号:201501)。

1.3仪器与设备 ZF型紫外透射反射分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；梯度PCR仪(BIO-RAD)；Multistrike MK3型酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4动物分组与造模 60只清洁级SD雌性大鼠按体质量随机分为正常对照组、维甲酸模型组、仙灵骨葆组(312 mg/kg)和当羊骨片低、中、高剂量组(250，500，1 000 mg/kg)，共6组，每组10只。除正常对照组，其余各组动物灌胃维甲酸70 mg/kg，连续灌胃14 d，建立大鼠OP模型。造模的同时，各给药组给予相应剂量的药物，正常对照组与维甲酸模型组给予同体积的蒸馏水。造模停止后，继续给药14 d。第29天取材。

1.5子宫质量指数测定 取材前称取大鼠体质量，处死大鼠后取子宫，并轻压挤出子宫液体，滤纸吸干，称取质量。按公式计算：子宫质量指数=大鼠子宫质量/大鼠质量。

1.6血清TGF-β1测定 腹主动脉取血10 ml，4℃，离心15 min取上清液，-80℃保存，按照试剂盒所附说明书检测血清TGF-β1水平。

1.7骨组织TGF-β1 mRNA表达水平测定 采用Trizol法提取总RNA。紫外可见分光光度计测定总RNA纯度及浓度后琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。PCR反应条件：93℃×2 min，93℃×30 s,55℃×30 s,72℃×1 min,30个循环，72℃×7 min。GAPDH(332 bp)上游引物：5′-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′,下游引物：5′-GTGCTGAGTATCGTGGAG-3′。TGF-β1(254 bp) 上游引物：5′-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3′,下游引物：5′-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3′。PCR产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳，确定PCR反应产物。应用Gel pro32凝胶图像分析软件进行定量分析，以目的条带吸光度与GAPDH条带吸光度比值，作为目的基因mRNA表达的相对水平。

1.8骨组织形态观察 大鼠处死后取左侧胫骨，剔除肌肉筋膜组织，称重，4 %多聚甲醛固定48 h，10 %乙二胺四乙酸二钠溶液脱钙6 w，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)充分冲洗2次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋组织切片，厚度5 μm，苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察。

1.9统计学方法 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组子宫质量指数比较 与正常对照组比较，维甲酸模型组子宫质量指数显著降低(P<0.01)；与维甲酸模型组比较，当羊骨片中、高剂量组子宫质量指数显著增加(P<0.05，P<0.01)，当羊骨片低剂量组及仙灵骨葆组子宫质量指数均高于维甲酸模型组，但无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.2各组血清TGF-β1水平及股骨TGF-β1 mRNA比较 与正常对照组比较，维甲酸模型组血清TGF-β1水平及股骨TGF-β1 mRNA表达均显著降低(P<0.01)；与维甲酸模型组比较，当羊骨片高剂量组血清TGF-β1水平及股骨TGF-β1 mRNA表达均显著增加(P<0.05，P<0.01)，仙灵骨葆组与当羊骨片中剂量组股骨TGF-β1 mRNA表达显著升高(P<0.01)，而血清TGF-β1水平均高于维甲酸模型组，但无显著差异(P>0.05)。见表1，图1。

2.3当羊骨片对骨组织形态的影响 在正常对照组可见骨小梁较密集，均匀分布，骨髓腔规则分布；而在维甲酸模型组骨小梁变薄、变细、稀疏断裂不连接，有的成“纽扣”状，网状结构被破坏，骨髓腔明显变大呈不规则分布，成骨细胞减少，破骨细胞增多；仙灵骨葆组及当羊骨片中、高剂量组发现骨小梁增多、变粗，骨髓腔变小且规则分布，成骨细胞明显增多，破骨细胞减少，见图2。

表1 各组子宫质量指数、血清TGF-β1及股骨TGF-β1 mRNA比较

与正常对照组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05

1～6：正常对照组、维甲酸模型组、仙灵骨葆组、当羊骨片低剂量组、当羊骨片中剂量组、当羊骨片高剂量组图1 各组股骨TGF-β1 mRNA表达

图2 各组骨组织病理切片(HE，×200)

3 讨 论

维甲酸为维生素A的衍生物，能刺激破骨细胞并增强其活性，使骨吸收大于骨形成，从而影响骨代谢。维甲酸还可以降低卵巢功能，使雌激素分泌减少。维甲酸致OP大鼠模型在骨组织形态学表现、雌激素在骨组织的反应及发病症状与人类均有较好的相似性〔4〕，被卫生部列为评价OP药物疗效的标准动物模型之一〔5〕。本文中维甲酸诱发大鼠OP模型成功。

中医学认为，OP属于 “骨痿”“骨痹”范畴，其发病与肾虚、肝虚、脾虚、血瘀密切相关，以虚为本，以淤为标〔6〕，临证分型多样。在治疗上，主要以补肾为主，补肝健脾、活血为辅。当羊骨片是由淫羊藿、补骨脂、当归组成的复方制剂。淫羊藿温补肾阳、强筋骨；补骨脂补肾填精、补肾温脾；当归益气养血、祛瘀止痛。三药合用能促进骨组织蛋白合成，提高其抗OP作用，同时三味中药还通过其他机制发挥治疗OP的作用。淫羊藿能直接调控下丘脑-垂体-性腺轴，产生类雌激素作用，提高大鼠血清雌激素水平，增强骨密度(BMD)〔7〕。淫羊藿可通过上调TGF-β1及骨形成蛋白-2的表达来促进骨髓间充质干细胞的成骨分化作用〔8〕。补骨脂可通过增强成骨细胞OPG的表达，抑制RANKL的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟，从而抑制骨吸收，达到防治OP的目的〔9〕。当归具有类雌激素作用及抗氧化作用，可增强雌激素合成，减少血清卵泡刺激素、黄体生成素及下丘脑神经递质释放，提高超氧化物歧化酶的活性〔10〕。

TGF-β1是具有多种功能的蛋白多肽，主要存在于骨组织和血小板中。TGF-β1是骨形成和骨吸收之间重要的耦联调节因子，对骨的修复和重建有重要作用。TGF-β1能刺激骨细胞DNA的合成与重组，促进成骨细胞增殖，促进骨和软骨细胞、细胞胶原和基质蛋白的合成并刺激基质钙化〔11〕；另外，TGF-β1抑制破骨细胞的增殖分化并诱导其凋亡，从而抑制骨吸收〔12〕。本研究提示当羊骨片可能是通过促进成骨细胞增殖分化，增加骨组织TGF-β1 mRNA表达增加，使得骨形成增强，另一方面降低破骨细胞活性，拮抗骨吸收，从而达到防治OP的作用。

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2孔祥鹤,牛银波,李宇华,等.OPG/RANK/RANKL系统与骨质疏松研究最新进展〔J〕.生命科学研究,2011;15(1):80-5.

3安晓蓓,魏 平,王俊祥,等.强直性脊柱炎继发骨质疏松及相关因素分析〔J〕.中华风湿病学杂志,2010;14(9):620-2.

4许 鹏,郭 雄,张银刚.维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠的效果及机理〔J〕.四川大学学报(医学版),2005;36(2):229-32.

5许碧莲,吴 铁,陈文双.壮骨肾宝对维甲酸致骨质疏松大鼠不同部位骨骼的影响〔J〕.中成药,2011;33(12):2048-51.

6吴 鑫.骨质疏松症的中医治疗及基础研究进展〔J〕.国医论坛,2014;29(4):69-70.

7赵利敬,李 沛.补肾中药干预骨质疏松症研究概况〔J〕.中医学报,2015;30(9):1326-8.

8吴 昊,查振刚,姚 平,等.淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究〔J〕.中国中西医结合杂志,2010;30(4):410-5.

9王建华,郭 敏,郑 丽,等.补骨脂素干预大鼠成骨细胞骨保护素/核因子κB受体激活因子配体mRNA的表达〔J〕.中国神经再生研究,2010;14(37):6927-30.

10Xie QF,Xie JH,Dong TT,etal.Effect of a derived herbal recipe from an ancient Chinese formula,Danggui Buxue Tang,on ovariectomized rats〔J〕.J Ethnopharmacol,2012;144(3):567-75.

11郭铁峰,周明旺,李盛华,等.转化生长因子β1对软骨组织代谢影响的研究进展〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2013;17(15):2827-34.

12钟如意,伍西羽,陈 胜,等.女性护骨素和转化生长因子-β水平对骨转换率的影响〔J〕. 中国骨质疏松杂志,2014;20(4):387-91.

河北省重大技术创新项目(No.07276444Z)

张晓峰(1962-),男,教授,博士,硕士生导师，主要从事胃肠道疾病研究及中药新药研发。

尹 鑫(1985-),女,在读硕士,主要从事中药药理研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)20-4988-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.014

〔2016-09-16修回〕

(编辑 曹梦园)