曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

张梦云 杨晓欧 李秀华 冯翔宇 彭玉娟

(承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

1 沧州市人民医院 2 泰安市第一人民医院

曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

张梦云 杨晓欧 李秀华 冯翔宇1彭玉娟2

(承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

目的研究曲美他嗪(TMZ)对慢性心力衰竭(CHF)大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax表达的影响。方法通过缩窄肾上腹主动脉建立CHF大鼠模型，选择30只雄性Wistar 大鼠随机分为假手术组、模型组、TMZ组，每组10只。监测各组心脏血流动力学参数，采用苏木素-伊红(HE)染色观察各组肾脏形态结构改变，TUNEL法检测各组肾脏组织细胞凋亡指数(AI)；免疫组织化学法(SP法)检测各组肾脏组织中Bcl-2与Bax蛋白的表达水平，RT-PCR法检测Bcl-2、Bax mRNA 含量。结果与模型组比较，TMZ组大鼠肾小管排列整齐，肾小管细胞水肿、脱落减少；AI和Bax蛋白、 mRNA表达水平显著下降(P<0.01)；Bcl-2蛋白、 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。结论CHF时应用TMZ可通过抑制细胞凋亡保护肾功能，进而改善心功能。

曲美他嗪；肾脏；细胞凋亡；Bcl-2；Bax

慢性心力衰竭(CHF)时肾脏可能存在大量细胞凋亡，肾脏细胞凋亡是肾功能不全发生的重要原因之一〔1，2〕。肾功能不全在一定程度上影响并决定着CHF患者的预后，大大增加了心血管疾病的发病率和死亡率〔3〕。因此早期使用药物干预可能抑制或逆转细胞的损伤，进一步改善心肾功能。曲美他嗪(TMZ)是临床有效抗心肌缺血的新型代谢类药物〔4〕，同时TMZ还可能通过阻止线粒体介导的凋亡通路抑制细胞凋亡发生〔5〕。本文观察CHF时肾小管上皮细胞凋亡情况及TMZ的抗凋亡及保护作用。

1 材料与方法

1.1实验试剂 盐酸曲美他嗪(商品名：万爽力)，由瑞阳制药有限公司生产；TUNEL试剂盒购自美国罗氏(Roche)公司；Bax、Bcl-2兔抗多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；免疫组织化学试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司；Bax和Bcl-2引物与Trizol购自美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

1.2动物模型的制备及分组 30只清洁级Wistar大鼠，体质量200～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，全部大鼠均适应性喂养1 w，随机分为假手术组、模型组和TMZ组，每组10只，模型组和TMZ组大鼠均采用肾上腹主动脉缩窄术复制CHF模型〔6〕，术后连续3 d经腹腔注射给予20万U/d青霉素。术后常规喂养4 w，大鼠逐渐出现呼吸、心跳加快、精神萎靡、食欲减退等表现。检测血流动力学参数：左心室舒张末压(LVEDP)≥15 mmHg，标志CHF模型建立成功。假手术组大鼠只分离腹主动脉，不予结扎。TMZ组给予TMZ 10 mg·kg-1·d-1，假手术组及模型组连续4 w给予等量生理盐水灌胃〔7〕。

1.3血流动力学参数监测 终止大鼠观察时检测各组大鼠质量，通过腹腔进行注射麻醉，经右颈总动脉逆行插管至左心室，通过多导电生理记录仪监测各实验对象的LVEDP及左室内压上升与下降最大速率(±dp/dtmax)，准确详细记录各组大鼠实验数据。

1.4肾脏组织形态学观察 取新鲜大鼠肾脏组织，用4%多聚甲醛固定后，进行常规的脱水、透明、石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精下行至水、苏木素-伊红(HE)染色、梯度酒精上行脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，在400倍光学显微镜下观察各组大鼠肾脏组织的形态结构变化。

1.5肾脏组织细胞凋亡指数(AI)的检测 采用TUNEL法检测肾脏组织细胞凋亡情况，将肾组织经常规固定、脱水、石蜡包埋、切片，切厚5 μm，严格按照TUNEL染色试剂盒说明书进行操作，在200倍荧光显微镜下进行观察并计数，每个标本随机选取6个视野观察，分别对细胞凋亡数和细胞总数进行计数并求其平均值，计算肾脏组织AI。

1.6SP法检测肾脏组织Bcl-2、Bax蛋白表达 肾组织石蜡切片置于二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蒸馏水洗10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)液洗10 min，置入3%H2O2-甲醛溶液37℃ 30 min孵育清除内源性过氧化氢酶活性，采用微波法进行抗原修复，PBS浸泡15 min，滴加正常山羊血清37℃ 30 min，后加Bcl-2、Bax一抗(浓度均为1∶75)，4℃过夜，第2天37℃ 30 min复温，加二抗37℃ 40 min，加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液室温37℃ 40 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，以PBS代替一抗作为阴性对照。使用400倍光学显微镜观察并拍照，后用Imagepro Plus软件进行分析，以阳性表达产物面积与视野总面积的比值表示对应抗体相对表达含量。

1.7RT-PCR检测Bcl-2、Bax mRNA表达 严格按照Trizol说明书提取各组大鼠肾组织总RNA，分别采用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法测定总RNA的纯度和浓度。大鼠Bcl-2引物序列：上游5′-GACGAGAAGTGCTATTGGT-3′，下游5′-TCAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3′，扩增片段为205 bp；Bax引物序列：上游5′-TTTCATCCAGGATCGAGCAG-3′，下游5′-CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC-3′，扩增片段为263 bp；β-actin 作为内参，上游引物序列：5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物序列：5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，扩增片段为452 bp。PCR扩增条件：94℃，2 min；94℃，30 s；50℃～60℃，30 s；72℃，30 s第二步起循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳并摄像，使用Gel Pro Analyzer统计软件进行定量分析，以各组Bcl-2、Bax 吸光度(A)与其对应的β-actin(A)的比值分别表示各组Bcl-2、Bax mRNA表达水平。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组血流动力学指标比较 与假手术组比较，模型组LVEDP显著升高(P<0.01)，±dp/dtmax明显降低(P<0.01)，与模型组相比，TMZ组LVEDP明显下降(P<0.01)，±dp/dtmax显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 各组血流动力学指标比较

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，下表同

2.2各组肾脏组织病理学观察 假手术组大鼠肾小球与肾小管形态结构正常、排列整齐；模型组大鼠肾小管结构排列紊乱，上皮细胞肿胀、脱落明显，提示CHF时肾脏组织有所损害；TMZ组肾小管结构排列整齐，细胞脱落现象明显减轻。见图1。

图1 各组肾脏组织病理学观察(HE，×400)

2.3各组肾小管上皮细胞Bcl-2、Bax蛋白表达 Bcl-2、Bax蛋白阳性表达成分是分布于胞质内的棕黄色颗粒，与假手术组比较，模型组中Bcl-2表达明显减弱，而Bax表达显著增强(P<0.01)，提示肾组织细胞凋亡增多；TMZ组与模型组比较，Bcl-2表达有所增加，而Bax表达强度减弱(P<0.01)。见表2，图2。

2.4各组肾脏组织AI 荧光显微镜下，被激发出绿色荧光的细胞为凋亡细胞，假手术组仅有少量细胞凋亡；与假手术组比较，模型组细胞凋亡数目显著增多(P<0.01)，显示CHF时肾脏组织存在大量凋亡细胞；TMZ组中细胞凋亡数量比模型组明显减少(P<0.01)。见表2，图3。

2.5各组大鼠肾脏组织Bcl-2、Bax mRNA表达 与假手术组比较，模型组Bcl-2 mRNA表达水平显著下降，Bax mRNA表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，TMZ组Bcl-2 mRNA表达水平显著上升，Bax mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。见表2，图4，图5。

表2 各组肾脏组织AI、Bcl-2与Bax蛋白及mRNA表达比较

图2 各组肾脏组织Bcl-2、Bax蛋白表达(DAB，×400)

图3 各组肾脏组织细胞凋亡情况(TUNEL，×200)

M：Marker；1，4：假手术组；2，5：模型组；3，6：TMZ组；下图同图4 各组大鼠肾脏组织Bcl-2 mRNA的表达

图5 各组大鼠肾脏组织Bax mRNA的表达

3 讨 论

研究显示CHF时低心排血量、缺氧、神经体液的过度激活、炎症反应和氧化应激反应增强，可以引起肾脏细胞凋亡，最终导致肾衰竭〔8，9〕。Schumer等〔10〕指出肾组织缺血可能造成大量细胞丢失，而该过程与细胞坏死明显不同，是由凋亡介导的。

肾脏在受到各种损伤后往往会发生肾小管细胞凋亡，如烧伤，缺血，辐射，创伤或毒性损伤，早期及时干预肾脏组织继发的细胞凋亡可能是一个潜在的保护途径〔11〕。在线粒体凋亡通路中，细胞在Ca2+超载、一氧化氮(NO)、氧自由基大量形成等因素的刺激下，线粒体膜通透性转运孔(mPTP)会开放，使存在于线粒体内外膜间隙的细胞色素C和凋亡因子释放至细胞质内引起细胞凋亡的发生〔12〕。mPTP开放有赖于Bcl-2蛋白家族的调控，Bcl-2蛋白家族主要有抗细胞凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)和促细胞凋亡蛋白(如Bax和Bak)，而mPTP是否激活有赖于Bcl-2和Bax蛋白含量的比值，当接收到凋亡信号后Bax将从细胞质易位到线粒体外膜形成大量Bax/Bax同源二聚体，使mPTP开放，导致Cyt-C和凋亡因子释放〔13〕。而Bcl-2表达上调可形成结构相对稳定的Bcl-2/Bax异源二聚体，使大量同源二聚体解离，从而抑制细胞凋亡〔14〕。Bcl-2的过度表达还可引起细胞核谷胱甘肽聚集，影响核内氧化还原状态，阻止胞内Ca2+流动，阻断凋亡进程〔15〕。

TMZ对心脏和肾脏均可产生一定的保护作用〔16〕。TMZ对细胞的保护作用机制主要有：①TMZ可以抑制mPTP开放：TMZ通过增强呼吸链中辅酶Ⅰ活性，抑制活性氧自由基(ROS)的生成，继而减轻线粒体膜的损伤和限制mPTP的开放，从而抑制细胞色素C的释放，防止细胞凋亡的发生〔4，5〕。②TMZ可选择性抑制线粒体长链3-酮酰辅酶A硫解酶，从而减少脂肪酸氧化，促进葡萄糖的有氧氧化，维持三磷酸腺苷(ATP)的产生和缺血细胞的能量代谢，减少氧化应激相关的游离酸产生的不利影响〔5，17〕。③TMZ能够减少细胞内Na+、Ca2+超载，抑制中性粒细胞浸润和氧自由过度生成，具有抗氧化、抗凋亡等多种细胞保护作用〔18〕。ROS生成增多将造成线粒体膜电位势能下降从而导致mPTP开放，引起细胞凋亡〔19〕。因此，根据TMZ对细胞保护的相关作用机制，它可以通过保护肾小管缺血上皮细胞线粒体膜结构，加强能量代谢，降低H+、Na+、Ca2+在细胞内的聚集，减少氧自由基生成，从而减少细胞凋亡。

本研究表明TMZ在改善心功能的同时，可能通过抗氧化应激作用抗肾小管细胞凋亡而改善肾功能。TMZ抗细胞凋亡的分子机制可能与凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax密切相关。

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河北省卫生计生委资助课题(No.20110180)

李秀华(1967-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事慢性心力衰竭病理生理研究。

张梦云(1988-),女，在读硕士，主要从事慢性心力衰竭病理生理研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)20-4982-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.012

〔2017-07-16修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)