禽波氏杆菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位预测

袁 朋，朱瑞良，崔晨晨，杨萍萍

(山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安271018)

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1642-1647

袁朋，朱瑞良，崔晨晨，等. 禽波氏杆菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位预测[J].浙江农业学报，2017，29(10)： 1642-1647.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.07

2017-03-23

国家自然科学基金项目(31602067，31272595)；山东省自然科学基金项目(ZR2014CM044)；山东省“双一流”奖补资金

袁朋 (1985—)，男，山东德州人，硕士研究生，实验师，研究方向为预防兽医学。E-mail: yp8511@163.com

*通信作者，杨萍萍，E-mail: ppyang@sdau.edu.cn

禽波氏杆菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位预测

袁 朋，朱瑞良，崔晨晨，杨萍萍*

(山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安271018)

试验旨在对禽波氏杆菌的血凝素HagA蛋白的二级结构与B细胞抗原优势表位进行预测，探讨以血凝素HagA蛋白制作单克隆抗体的可能性。首先对禽波氏杆菌的血凝素hagA基因进行了PCR扩增以及序列测定，利用生物信息学的相关软件与分析方法，对血凝素HagA蛋白的二级结构以及B细胞抗原表位进行分析预测。经综合分析表明，禽波氏杆菌的HagA蛋白氨基酸序列中存在7个B细胞优势抗原表位区域，6个可能的糖基化位点。研究结果为进一步分析禽波氏杆菌HagA蛋白的生物学功能、制备单抗和研制疫苗等奠定了基础。

禽波氏杆菌；HagA蛋白；二级结构；B细胞抗原表位预测

在生物信息学与计算机技术日益发展的今天，越来越多的人利用生物信息学相关软件和网络服务器来预测功能蛋白的结构与抗原表位信息，既节约实验室工作量，又可避免在传统表位研究中的盲目性[5-7]。本研究对实验室保存的禽波氏杆菌菌株的hagA基因扩增测序，运用计算机软件与生物信息学方法来分析HagA蛋白的二级结构、亲水性、表面可及性，从而对血凝素HagA蛋白进行初步的探索，皆在为进一步研究HagA蛋白的功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

禽波氏杆菌(LL、XT)株，由山东农业大学预防兽医学实验室分离鉴定并保存。

1.2 载体与试剂

PMD18-TVector、细菌DNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒均购自大连宝生物工程公司。胶回收试剂盒购自TIANGEN公司。

1.3 引物

根据GenBank已发表的禽波氏杆菌197N菌株的序列，BA3062538-BA3064682之间的序列为hagA基因序列，通过DNAstar软件找到hagA基因序列的开放阅读框，确定BA3062685至BA3064364之间序列为HagA蛋白的基因序列。利用Premier5.0引物设计软件设计1对引物对hagA基因序列进行扩增。引物序列如下：

干部教育培训是干部队伍建设的先导性、基础性和战略性工程，互联网的广泛应用为干部教育提供了新的平台。《2018－2022 年全国干部教育培训规划》指出要统筹整合网络培训资源，建设兼容、开放、共享、规范的全国干部网络培训体系。自2012 年中国干部网络学院开通，到十九大以来干部网络教育步入新时代，干部网络教育以其能够跨越时空局限的优势已经成为干部教育领域不可或缺的一部分。

HagA-F: 5′-ATGGGGCTTTTGATGTGTTATTCG-3′

HagA-R: 5′-TTAGAACTGAGCTTGCAGCGTCA-3′

引物序列由华大基因有限公司合成，扩增基因产物片段大小约为1 680 bp。

1.4 禽波氏杆菌hagA基因克隆与测序

利用细菌DNA提取试剂盒进行禽波氏杆菌基因组DNA提取，以提取DNA为模板进行PCR扩增。反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。电泳鉴定并回收目的DNA，连接pMD18-T载体，并转化到DH5α感受态细胞中，接种到含有氨苄青霉素(100 mg·L-1)的LB平板上进行培养，12 h后挑取阳性克隆菌落至LB液体培养基中培养。培养12 h后提取质粒，经PCR鉴定阳性后送华大基因有限公司测序。

1.5 禽波氏杆菌HagA蛋白的二级结构预测

将完成测序DNA序列利用DNAStar软件翻译为氨基酸序列，利用EXPASY网络服务器上的SOPMA与GOR方法分析预测禽波氏杆菌HagA蛋白的二级结构[8-9]。

1.6 禽波氏杆菌HagA蛋白B细胞表位预测

选取3种主要参数进行分别预测，包括采用Kyle Doolittle的氨基酸亲水性标准预测亲水性参数(Hydrophilicity)[10]、用Jameson-Wolf方法预测抗原指数(Antigenicity index)[11]、以及用Emini方法预测可及性参数(Accessibility)[12]，比较各个参数的预测结果，进行综合分析，然后确定HagA蛋白的B细胞抗原优势表位。

2 结果与分析

2.1 禽波氏杆菌hagA基因的PCR扩增

禽波氏杆菌hagA基因的PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中显示约为1 680 bp，片段大小与预期相符，电泳结果见图1。

2.2禽波氏杆菌HagA蛋白理化性质及特定位点分析

M， DL2000 DNA相对分子质量标准； 1， 阴性对照； 2， 禽波氏杆菌(LL株)HagA； 3， 禽波氏杆菌(XT株)M， DL2000 DNA marker; 1， Negative control; 2， Bordetella avium HagA(LL strain); 3， Bordetella avium HagA(XT strain)图1 hagA基因PCR的扩增结果Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products for hagA gene

禽波氏杆菌hagA基因测序结果经DNAstar软件翻译为蛋白质序列表明LL与XT分离株的氨基酸同源性为100%，由559个氨基酸序列组成。与197N菌株hagA基因序列核苷酸同源性为89.2%。利用ProtParam分析软件对HagA蛋白的氨基酸序列进行理化性质分析，分析结果显示HagA蛋白的原子总数为8 652，分子式为C2754H4307N751O831S9。理论pI值为9.30，相对分子质量为61 522.56 u。N末端序列为Met(蛋氨酸)，酸性氨基酸总数(Asp+Glu)为43，碱性氨基酸总数(Arg+Lys)为53，不稳定系数为35.24，属于稳定性蛋白。特定位点分析结果见表1。

2.3 禽波氏杆菌HagA蛋白二级结构的预测

利用EXPASY网络服务器上的SOPMA与GOR方法进行HagA蛋白二级结构的预测，预测结果见图2所示。两种方法对HagA蛋白的预测结果基本相同，均表明HagA蛋白二级结构中柔性区域主要为无规转曲，且无规转曲有13个肽段位置，详见表2。

2.4禽波氏杆菌HagA蛋白B淋巴细胞抗原表位的预测

首先应用KyleDoolittle的方法对HagA蛋白进行亲水性预测，结果表明，HagA蛋白的亲水性较大的区域有15个区段，再应用Jameson wolf方案预测HagA蛋白的抗原指数较高的区段，结果显示有17个区段的抗原指数较高，最后应用Eminni方案预测HagA蛋白表面的可及性参数，结果显示有11个区段出现在蛋白表面的可能性较大，而且表面可及性区段都位于HagA蛋白的亲水性较高的区域。结果见图3和表2所示。

不同方法预测的抗原表位的个数和出现的位置略有不同，但不同的预测方法一致表明在第103～112位、第127～133位、第158～163位、第205～212位、第243～251位、第327～331位、第356～368位这7个区域B淋巴细胞抗原表位的存在性较高。

表1禽波氏杆菌HagA蛋白功能区及作用位点

Table1The functional domains and activity sites of HagA protein

名称Name氨基酸序列及结合位点Aminoacidsequenceandbindingsites糖基化位点N⁃glycosylationsiteNRTQ(67) NLSR(130) NESL(267) NNSR(357) NVSY(383) NVSS(475)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点CaseinkinaseⅡphosphorylationsiteSSID(89) SRDD(132) SVVD(155) SFTE(226) SNGD(406) THAE(416)蛋白激酶C磷酸化位点ProteinkinaseCphosphorylationsiteSPR(10) TER(73) TYK(102) TPK(109) SYK(211) TLK(321) TRK(325)SYR(374) SYR(385) SGR(544)N⁃肉豆蔻酰化位点N⁃myristoylationsiteGLLMCY(2) GIGLAK(17) GQTQSI(45) GNEINR(51) GVVNTV(98) GLSYTG(271) GNMATV(276) GVKSNF(334) GNTLGS(344) GSVGAL(348) GI⁃HRGW(488) GLDYGR(504) GLNIAM(521) GVFLTL(550)依赖于cAMP和cGMP的蛋白磷酸化激酶位点cAMP⁃andcGMP⁃dependentproteinkinasephosphorylationsiteRRSS(387)

表2多种预测方法对禽波氏杆菌HagA蛋白B细胞抗原表位的预测结果

Table2Epitopes predicted by various methods inB.aviumHagA protein

预测方法Methods肽段位置Results(Peptidesequence)二级结构Secondarystructure42⁃48、84⁃114、127⁃133、147⁃163、176⁃188、204⁃212、242⁃255、271⁃310、327⁃349、356⁃368、381⁃389、418⁃427、434⁃491、497⁃517、514⁃550亲水性Hydrophilicity43⁃84、101⁃115、122⁃141、155⁃166、205⁃218、228⁃234、243⁃254、278⁃288、307⁃318、322⁃334、355⁃408、417⁃442表面可及性Surfaceprobability6⁃9、59⁃82、103⁃112、124⁃136、158⁃163、204⁃215、229⁃233、243⁃251、307⁃316、322⁃331、355⁃392抗原性Antigenicity6⁃12、44⁃86、102⁃115、122⁃140、155⁃164、203⁃222、228⁃236、241⁃251、278⁃293、308⁃316、321⁃333、342⁃352、356⁃370、375⁃392、415⁃477、504⁃512、542⁃552

SOPMA与GOR4为两种不同的蛋白二级结构预测方法。h， α-螺旋；e， β-片层；c， 无规卷曲；t， β-转角SOPMA and GOR4 indicated different prediction methods. h， α-helix; e， β-sheet; c， Random coils; t， β-turn图2 B. avium HagA 二级结构预测Fig.2 Secondary structure prediction of B. avium HagA

图3 B. avium HagA蛋白亲水性、抗原指数及其表面可能性分析Fig.3 Analysis of hydrophilicity plot， antigenic index and surface probability of B. avium HagA protein

3 讨论

禽波氏杆菌已经成为威胁养禽业的一种广泛存在的细菌，由于其基因组比较大，编码的蛋白也较为复杂[13-15]。目前针对其外膜蛋白OmpA蛋白研究比较多，而对HagA蛋白国内鲜有报道，有关文献已经报道作为一种重要的毒力因子，HagA血凝素蛋白定位于菌膜表面是波氏杆菌特有表面结构蛋白，其是否具有良好的抗原性需进一步探索。本试验对本实验室分离保存的禽波氏杆菌(LL、XT)菌株进行HagA基因克隆测序，结果表明LL与XT分离株的氨基酸同源性为100%。以此为基础，针对HagA蛋白的氨基酸序列利用生物学相关软件预测其B细胞抗原优势表位，为研究HagA蛋白的抗原性以及功能提供理论基础。

本研究首先运用ProtParam分析软件对禽波氏杆菌HagA蛋白的氨基酸序列进行理化性质及特定位点进行分析，对HagA蛋白有了基本了解。然后针对蛋白质抗原决定簇的预测，采用多种单参数预测模型和相关分析软件结合的方法进行，多种参数的综合考虑避免了单参数预测的局限性，提高了准确性[16]。应用生物学相关软件对HagA蛋白二级结构、亲水性、表面可及性三种尤为重要的参数进行预测。其中对二级结构的预测采用SOPMA、GOR4两种方法结合的方式进行，两种方法预测的结果相差不多，二级结构主要以无规转曲和α-螺旋为主，有少量的β-片层，SOPMA预测的结果中有少量的β-转角。亲水性、表面可及性以及抗原性参数分别按照KyleDoolittle、Eminni、Jameson wolf的方法进行预测，多种预测方法进行综合分析，结果显示位于氨基酸序列中第103～112位、第127～133位、第158～163位、第205～212位、第243～251位、第327～331位、第356～368位，这7个区段为B细胞抗原表位优势区域。

本研究首次针对禽波氏杆菌HagA蛋白利用生物学分析软件进行了二级结构与B细胞抗原优势表位的预测，为进一步探索HagA蛋白的抗原性以及其他生物学特性提供了理论依据，同时也为用HagA蛋白研制单抗以及对其免疫机理的研究提供了参考。

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SequencingandB-cellepitopespredictionofBordetellaaviumHagAprotein

YUAN Peng， ZHU Ruiliang， CUI Chenchen, YANG Pingping*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

This article is carried out to predict the secondary structure ofBordetellaaviumHagA and the dominant epitope of B cell antigen， in order to discuss the possibility of HagA protein in the production of monoclonal antibodies. In this study，hagAgene ofB.aviumwas amplified， cloned and sequenced. The secondary structure and B cell epitopes of the HagA protein ofB.aviumwere analyzed and predicted subsequently by using bioinformatics software. The results showed that theB.aviumHagA protein was supposed to include 7 potential antigen epitopes and 6 potential glycosylated sites. The results provide a theoretical basis for the further study of immune mechanisms， monoclonal antibodies preparation and epitope vaccine design.

Bordetellaavium; HagA; secondary structure; B-cell epitope prediction

S858.3

A

1004-1524(2017)10-1642-06

（责任编辑张 韵)