烟草NtCIPK2基因的克隆及表达分析

卓 维，陈 倩，鲁黎明，李立芹

(四川农业大学 农学院，四川 成都 611130)

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1611-1619

卓维，陈倩，鲁黎明，等．烟草NtCIPK2基因的克隆及表达分析[J]．浙江农业学报，2017，29( 10) : 1597 - 1604．

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.01

2017-04-14

植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题(SKLPPBKF 1505, SKLPPBKF 1506)

卓维(1994—)，女，重庆人，硕士研究生，主要从事植物分子生物学研究。E-mail: 992167898@qq.com

*通信作者，李立芹，E-mail: liliqin88@163.com

烟草NtCIPK2基因的克隆及表达分析

卓 维，陈 倩，鲁黎明，李立芹*

(四川农业大学 农学院，四川 成都 611130)

CIPK(CBL-interacting protein kinase)是一类具有生物活性的丝/苏氨酸蛋白激酶，通过与类钙调神经素 B 亚基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)相互作用从而调节植物在适应或抵制非生物逆境胁迫中的生理活动。基于同源序列克隆烟草K326中NtCIPK2基因cDNA全长，采用qRT-PCR分析NtCIPK2的组织及逆境胁迫下特异性表达。结果表明，该基因全长1 341 bp，编码446个氨基酸残基，预测分子量为50.3 ku，等电点为8.90。同源性分析结果显示，该蛋白与绒毛状烟草(Nicotianatomentosiformis)CIPK2有95%的同源性，故命名为NtCIPK2。生物信息学分析表明，该蛋白是一个亲水蛋白，其N端含有活化环结构域S_TKc，C端含有调节结构域CIPK-C，可能定位在质膜。组织表达分析发现，该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达，其中茎中表达量最高。逆境胁迫试验表明，该基因受低钾、高盐、干旱、H2O2和ABA诱导，参与烟草非生物逆境胁迫的响应。

烟草；NtCIPK2；克隆；生物信息学；基因表达

烟草是我国重要的模式生物和经济作物，无论是在基础研究领域，还是在农业经济方面，都发挥着重要的作用。低钾、干旱、盐碱、冷害等非生物胁迫严重影响烟叶的产量及品质，尤其是低钾胁迫影响为甚[1]。现今在我国钾素资源相对贫乏，烟叶中钾含量也普遍偏低。所以如何提高烟叶中钾含量及烟草的抗逆性成为当前重要的研究方向。

Ca2+是植物体中普遍存在的第二信使，在植物生长发育以及胁迫调节中发挥重要作用。研究表明，植物在受到逆境胁迫时，首先引发细胞内钙离子浓度的变化[2]，改变的Ca2+浓度会被相应的Ca2+感受器感知，并进一步将信号传递至下游。类钙调神经素B亚基蛋白CBL是植物中一类特殊的钙感受器，能识别不同的钙信号。CIPK是一类植物中特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[3]。CBL与CIPK相互作用后能解除CIPK自抑制，形成CBL-CIPK复合体，活化状态的复合体能磷酸化修饰下游靶蛋白，从而解码钙信号，并进一步将信号转化为细胞的生理反应[4-5]。

CIPK蛋白激酶家族中每个成员的调节结构域中均含有一个保守的24个氨基酸组成的FISL基序(又称NAF结构域)，该基序是一个自抑制结构域并介导与CBL的作用[6]。研究发现，水稻中有27个，拟南芥中有26个，杨树中有33个CIPK家族成员[7-8]。CIPK在植物响应高盐、低温、高温和低钾信号转导过程中发挥重要作用[9]。野大麦HbCIPK2在干旱、高盐和ABA胁迫下表达增强[10]。玉米ZmCIPK2在高盐、PEG、低温和热处理下被大量诱导上调[11]。烟草中NtCIPK23受到干旱、盐胁迫诱导[12]。

本研究从普通烟草K326中克隆到一个NtCIPK2基因，利用生物信息学分析NtCIPK2蛋白的理化性质、疏水性，并进行蛋白结构预测、信号肽预测以及同源性分析，同时运用qRT-PCR研究其在烟草根、茎、叶、花组织中的表达水平，以及低钾、高盐、干旱、H2O2和ABA非生物逆境胁迫下该基因的表达水平，旨在为今后NtCIPK2的功能研究奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

本试验使用的植物材料为普通烟草K326。

大肠埃希菌感受态DH5α购自Vazyme Biotech公司；目的基因的克隆及回收使用的Trizol试剂、载体PMD19-T、高保真Pfu酶，cDNA合成试剂盒，SYBR Green Master mix、限制性内切酶、DNA Ligation Kit 2.0等试剂购自TaKaRa，DNA凝胶纯化回收试剂盒购自天根公司；引物合成与测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料处理

首先挑选籽粒饱满、大小一致的烟草种子进行表面消毒，先用75%的乙醇消毒30 s，然后10%的次氯酸钠溶液消毒2次，每次10 min，最后用无菌水反复清洗5～6次后播种于MS培养基上，置于16 h光/8 h暗，25 ℃的光照培养箱中培养15 d后，挑取长势一致的幼苗进行低钾、高盐、干旱、H2O2和ABA处理，每个处理设有3盘重复，处理相应时间(0、3、6、12、24 h)后进行整株取样。低钾培养基是去掉MS培养基中的KNO3，并且用NH4H2PO4代替KH2PO4，浓度为10 μmol·L-1K+，其余成分相同。高盐、干旱、H2O2和ABA处理培养基是在MS培养基中分别加入NaCl(200 mmol·L-1)、PEG-6000(5%)、H2O2(10 mmol·L-1)和ABA(1 μmol·L-1)。

1.2.2 烟草NtCIPK2 基因的克隆

参考GenBank收录的绒毛状烟草CIPK2序列(XM_018779044.1)，采用同源克隆的方法，用DNAMAN软件设计全长引物NtCIPK2-F和NtCIPK2-R(表1)。扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；35个循环。目的片段纯化后与pMD19-T载体16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态，随后在含有氨苄青霉素(Ampicillin)的LB固体平板上进行筛选，菌落PCR检测筛选阳性克隆，送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.3 烟草NtCIPK2基因生物信息学分析

利用ExPASyProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam)分析 NtCIPK2编码蛋白的理化性质；用在线软件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白的疏水性；运用IBCP的在线工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html)预测蛋白的二级结构；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在线预测NtCIPK2的三级结构；利用 Signal-P 在线预测蛋白质信号肽；利用 CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)软件在线分析NtCIPK2编码蛋白氨基酸的结构域；采用在线工具PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)预测NtCIPK2的亚细胞定位；运用MEGA5、Bio Edit及Clustalx-2.0.9软件以邻近法构建系统进化树。

1.2.4 烟草 NtCIPK2 基因的表达分析

根据基因序列，采用Primer Premier 5.0设计qRT-PCR引物NtCIPK2-qF和NtCIPK2-qR，采用烟草的18SrRNA为内参进行表达差异研究。qRT-PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s和60 ℃延伸45 s，进行39个循环。所有的样品都设置3个重复，反应结束后，基因相对表达水平用2-ΔΔCt方法进行计算(表1)。

2 结果与分析

2.1 NtCIPK2基因克隆

提取烟草叶片总RNA，以其反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，电泳结果显示在1 000～1 500 bp的位置上有清晰的条带(图1)。将该条带回收纯化后与pMD19-T载体进行连接，

表1引物序列

Table1Primer sequences

引物名称Primername引物序列PrimersequencesNtCIPK2⁃FNtCIPK2⁃RNtCIPK2⁃qFNtCIPK2⁃qR18sF18SR5′⁃ATGGAGGAGAAGAAAGGAAA⁃3′5′⁃CTAACTATTAATTGGCTGCT⁃3′5′⁃TGCCAATGCTAATGTCGA⁃3′5′⁃TTCCTCCTTCTGATCCTTTC⁃3′5′⁃CCTACGCTCTGTATACATTAGC⁃3′5′⁃GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC⁃3′

1， NtCIPK2基因；M， Marker 1， NtCIPK2 PCR product; M， Marker图1 NtCIPK2基因PCR扩增电泳图Fig.1 Electrophoresis analysis of NtCIPK2 PCR product

转化大肠埃希菌DH5α。运用菌落PCR方法鉴定阳性克隆，随机挑选3个阳性克隆送至测序公司进行测序。测序结果显示，目的片段大小为1 341 bp，通过NCBI上Blast比对发现该序列与普通烟草CIPK2(XM_016635422.1)序列完全一致。

2.2 NtCIPK2基因的生物信息学分析

2.2.1 NtCIPK2编码蛋白的理化性质及疏水性分析

蛋白质的理化性质包括氨基酸组成、分子质量、等电点和不稳定系数等。分析显示，NtCIPK2基因共编码446个氨基酸，其中亮氨酸(11.2%)，赖氨酸(10.1%)，谷氨酸(8.7%)，丝氨酸(7.0%)含量偏高，色氨酸(1.1%)含量最低。该蛋白预测的分子量为50.3 ku，理论等电点pI为8.90，不稳定系数(instability index)为32.66，说明该蛋白可能是一个稳定的碱性蛋白。同时，其亲水性平均指数为-0.265，用在线软件ProtScale进行疏水性分析(图2)，结果预测该蛋白属于亲水性蛋白。

2.3.2 NtCIPK2蛋白的二级、三级结构预测

利用IBCP的在线工具SOPMA对NtCIPK2蛋白的二级结构进行预测发现，该蛋白中35.43%的氨基酸参与α-螺旋(Alpha helix)，30.72%的氨基酸参与无规则卷曲(random coil)，21.52%的氨基酸参与延伸链(extended strand)，12.33%的氨基酸参与β-转角(Beta turn)，由此可见，该蛋白二级结构的最大元件为α-螺旋(图3)。运用 SWISS-MODEL对NtCIPK2的三级结构进行了预测，RasTop软件进行显示(图4)，并将结果与二级结构预测进行比照，结果较为统一。

图2 NtCIPK2蛋白疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of NtCIPK2 protein

图3 NtCIPK2蛋白的二级结构预测Fig.3 Predicted secondary structure of NtCIPK2 protein

图4 NtCIPK2蛋白的三维结构预测结果Fig.4 The predicted advanced structure of NtCIPK2 protein

2.3.3 NtCIPK2蛋白信号肽预测

蛋白质信号肽的预测有助于区分其功能结构域和细胞定位。利用Signal-P4.1软件分析NtCIPK2蛋白信号肽，根据信号肽序列的特征，采用神经网络方法或隐马氏模型方法预测信号肽位置及切割位点。其中用Y-score maximum来判断信号肽切割位点，用mean S-score来判断是否是分泌蛋白(图5)，预测结果显示，Score为0.104，小于0.5，则预测该蛋白不是分泌蛋白，不存在信号肽。

2.3.4 NtCIPK2蛋白的结构域及亚细胞定位分析

利用NCBI数据库的CDD软件对NtCIPK2编码蛋白的结构域进行分析(图6)，结果表明，该蛋白在N端含有保守的活化环结构域(S_TKc)，此结构域从第13位到267位氨基酸结束，该区域磷酸化可以激活CIPK的活性。另外，其C端含有一个与CBL相互作用的调节结构域(CIPK-C)，此结构域从318位到431位氨基酸结束，是确定CIPK家族蛋白的重要标志。

利用PSORT在线预测NtCIPK2的亚细胞定位，结果显示，该蛋白在质膜上占0.700，在微体上占0.300，在内质网中占0.200，在线粒体内膜中占0.100，预测NtCIPK2可能定位在质膜上。

2.3.5 NtCIPK2同源性分析

把NtCIPK2编码的氨基酸序列在 NCBI 数据库中进行 Blast比对，按照相似性程度高低选择19个基因编码的氨基酸序列(包括 NtCIPK2)构建系统进化树(图7)，结果表明，NtCIPK2与绒毛状烟草CIPK2(XP_009630199.1)、马铃薯CIPK18(XP_006365327.1)、番茄CIPK(XP_015076663.1)等具有较高的氨基酸序列同源性，分别为95%、94%、89%，与油棕CIPK18(XP_010937988.1)和菠萝CIPK2(OAY79966.1)的同源性最低，均为69%。

图5 NtCIPK2的信号肽预测Fig.5 Signal peptide prediction of NtCIPK2

图6 NtCIPK2的结构域分析Fig.6 Structure domain analysis of NtCIPK2

图7 NtCIPK2进化树分析Fig.7 The phylogenetic tree analysis of NtCIPK2

2.4 NtCIPK2的组织表达分析

以生长60 d K326无菌苗的根、茎、叶以及成熟苗盛花期的花为材料提取RNA，反转录得到的cDNA为模板进行qRT-PCR反应，分析NtCIPK2在各个组织的表达量，NtCIPK2在根、茎、叶、花中均有表达，其中在茎中的表达量最高，其次是在根中的表达，在花中的表达量最低。在茎中表达量是在根中的2.6倍，是叶中的10.7倍，是花中的24.1倍。说明NtCIPK2主要在烟草K326植株的茎中表达(图8)。

2.5五种非生物逆境胁迫下NtCIPK2的表达分析

采用qRT-PCR对NtCIPK2在低钾(10 μmol·L-1K+)、5% PEG-6000、10 mmol·L-1H2O2、200 mmol·L-1NaCl和1 μmol·L-1ABA处理后的表达量进行分析。低钾处理后，NtCIPK2表达量在12 h达到最大为对照(0 h)的5.11倍。5% PEG-6000和H2O2处理后，该基因都在3 h达到最大，分别为对照(0 h)的1.63倍和1.87倍(图9)。

高盐(200 mmol·L-1NaCl)处理后，NtCIPK2表达量在6 h达到最大，为对照(0 h)的5.95倍；在1 μmol·L-1ABA处理下，该基因表达量先下降后上升，12 h最低仅为对照(0 h)的39.1%，24 h最大为对照(0 h)的4.99倍(图9)。

3 讨论

CIPK基因家族广泛分布于高等植物根、茎、叶等组织器官中。本试验从普通烟草K326中克隆到一个CIPK家族成员NtCIPK2基因的cDNA序列，通过对其编码的蛋白CIPK2结构域分析，其N端激酶催化域含有一个典型激活环S_TKc，C-端含有一个调节结构域CIPK-C。调节结构域中包含的高度保守NAF结构域是CIPKs家族的典型特征[13]。CIPK分子的活化依赖于NAF基序的自我抑制与特定CBL的相互作用，两者共同解读植物胁迫下细胞的钙信号变化[14]。氨基酸序列比对分析发现，NtCIPK2与绒毛状烟草CPK2、马铃薯CIPK18等具有很高同源性。亚细胞定位预测结果表明，NtCIPK2可能定位在质膜中。在茄子中，SmCIPK2也定位到质膜上[15]，也有研究表明CIPK2定位在质膜和细胞核[10，16]。

不同组织之间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)The bars with different lowercase letters showed significance at the level of 0.05图8 NtCIPK2在烟草不同组织中的相对表达量分析Fig.8 Analysis of relative expression of NtCIPK2 in different tissues of tobacco

同一处理不同时间点的数据间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)Under the same treatment at different time, the bars with different lowercase letters showed significance at the level of 0.05图9 NtCIPK2在10 μmol·L-1 K+、5% PEG-6000和10 mmol·L-1 H2O2处理下的相对表达量Fig.9 Relative expression of NtCIPK2 under10 μmol·L-1 K+、5% PEG-6000和10 mmol·L-1 H2O2treatment

本研究利用qRT-PCR分析NtCIPK2在烟草K326不同组织中的表达水平，结果显示该基因在根、茎、叶、花中均有表达，茎中表达量最高。这与白刺NtCIPK2表达不一样，该基因在根中表达量最高[17]，原因可能与盐生植物耐盐性有关，白刺属于盐生植物。为保证植株正常生长，需从根部吸收更多水分和离子，通过细胞液中积累无机离子或合成有机溶质等方式进行渗透调节以减轻或避免伤害[18]；这与小麦TaCIPK2和TaCIPK25表达模式一致，该基因也在茎中表达最高[19-20]，推测烟草和小麦中NtCIPK2可能与茎中离子运输有关。

本研究发现，在高盐(200 mmol·L-1NaCl)处理下，NtCIPK2的表达量明显上调，6 h达到最大，这与小麦TaCIPK2表达模式一致[21]，表明NtCIPK2表达受高盐诱导。在1 μmol·L-1ABA处理下，NtCIPK2在0～12 h表达量降低，水稻OsCIPK2在ABA处理下表达量也先下调[22]。在5%PEG-6000模拟干旱处理下，NtCIPK2表达上调，3～24 h均受到诱导。有研究将大豆CIPK基因家族分为4个亚组，CIPK2属于Ⅳ亚组，属于Ⅳ亚组中的基因在干旱胁迫下反应明显[23]。例如，用20%PEG-6000处理玉米ZmCIPK2，该基因在6 h诱导最强烈[11]；用15%PEG-6000处理大麦HbCIPK2，该基因在3～12 h显著诱导，24 h小幅度下降[10]；但同样处理下，白梨PbCIPK2表达则受到抑制，12～24 h逐渐下降至最低[24]，以上均说明CIPK2基因与植物干旱胁迫相关。进一步研究表明，TaCIPK2蛋白通过增强细胞膜稳定性和调节ROS清除系统来增强植物抗旱能力[20]；水稻OsCIPK的诱导模式与其干旱应激反应因子相关，OsCIPK23的过表达能诱导多种抗旱相关基因的表达，从而间接地参与对干旱的响应[25-26]。

低钾(10 μmol·L-1K+)处理后，NtCIPK2表达量上调，12 h达到最大，表明NtCIPK2的表达受低钾处理诱导。不同植物CIPK2表达模式不同，不同CIPK家族成员对低钾胁迫反应不同。茄子SmCIPK2在低钾处理后，表达量上调，6 h达到最大[15]。甘蔗SsCIPK23、水稻OsCIPK10和玉米ZmCIPK9在低钾处理后其表达都被诱导[27-29]。但在低钾处理下CIPK2被诱导的机制尚未明确，目前AtCBL1/AtCBL9-AtCIPK23信号系统研究得较清楚。当胞外K+浓度低时，AtCBL1和AtCBL9能够通过与AtCIPK23互作，激活定位于质膜上的K+通道蛋白AtAKT1，促使K+内流进入细胞，进而调节低钾条件下植物K+的吸收[30]。

本试验选择5种处理(10 μmol·L-1K+、5%PEG-6000、10 mmol·L-1H2O2、200 mmol·L-1NaCl和1 μmol·L-1ABA)以研究NtCIPK2的表达模式，在不同的胁迫条件，该基因表达情况发生改变，暗示了该基因在低钾、干旱、盐胁迫、H2O2和ABA胁迫下发挥重要作用。但NtCIPK2蛋白在其发挥的具体作用，尚待进一步研究。今后可构建GFP融合表达蛋白确定其亚细胞定位，通过酵母双杂交实验寻找与NtCIPK2互作的蛋白，深入研究NtCIPK2基因的功能，为从分子水平阐明NtCIPK2蛋白在非生物逆境胁迫中的作用机制提供科学依据。

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CloningandexpressionanalysisofNtCIPK2geneinNicotianatabacum

ZHUO Wei， CHEN Qian， LU Liming， LI Liqin*

(CollegeofAgronomy，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

CIPK(CBL-interacting protein kinase)is a class of bioactive serine/ threonine protein kinase that interacts with the calcineurin B-like protein (CBL) to regulate the physiological activity of plants in adapting or resisting to abiotic stress. The homologous sequences were used to clone the full length cDNA ofNtCIPK2 gene in the tobacco cultivar K326， and qRT-PCR was used to analyze the tissue-specific and abiotic stress expression pattern ofNtCIPK2. The results showed that this gene contained 1 341 bp and encoded 446 amino acid. The predicted molecular weight was 50.3 ku and the isoelectric point (pI) was 8.90. The homology analysis showed that the protein had 95% homology withNicotianatomentosiformisCIPK2， thus it was named asNtCIPK2. Bioinformatics analysis showed that NtCIPK2 was a hydrophilic protein whose N-terminus contained a conserved active loop domain S_TKc and the C-terminus contained the regulatory domain CIPK-C， and might be localized in the plasma membrane. Expression patterns showed that the gene was expressed in roots， stems， leaves and flowers in mature stage， which has the highest expression in stems. Expression patterns under abiotic stress indicated the gene expression was induced by low-potassium， high-salt， drought， H2O2and ABA treatment， and involved in the response to abiotic stress inNicotianatabacum.

tobacco;NtCIPK2; cloning; bioinformatics; gene expression

S572

A

1004-1524(2017)10-1597-08

（责任编辑张 韵)