混合碳源对地衣芽孢杆菌发酵合成杆菌肽的影响

刘道奇，陈守文，李俊辉，陈雄，王志*

1(湖北工业大学，发酵工程教育部重点实验室，湖北省工业发酵协同创新中心，湖北省工业微生物重点实验室，湖北 武汉，430068)2(湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉，430062) 3(绿康生化股份有限公司，福建 蒲城，353400)

混合碳源对地衣芽孢杆菌发酵合成杆菌肽的影响

刘道奇1，陈守文2，李俊辉3，陈雄1，王志1*

1(湖北工业大学，发酵工程教育部重点实验室，湖北省工业发酵协同创新中心，湖北省工业微生物重点实验室，湖北 武汉，430068)2(湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉，430062) 3(绿康生化股份有限公司，福建 蒲城，353400)

在10 L发酵罐水平研究了地衣芽孢杆菌批发酵、补料(葡萄糖、乳糖)批发酵对细胞生长以及溢流代谢和杆菌肽合成的影响。批发酵过程中，细胞28 h达到峰值(91×108CFU/mL)后自溶，杆菌肽效价32 h达到峰值(960 U/mL)后逐渐降解。20～28 h流加葡萄糖批发酵的峰值生物量(24 h)为115×108CFU/mL，比对照提高了26%。但是，流加葡萄糖后杆菌肽合成速率(20～40 h)是17.2 U/(mL·h)，仅为补料前(20 h之前)的53%。基料添加乳糖批培养的峰值生物量(32 h)为110×108CFU/mL，比分批发酵提高了20.6%，并与流加葡萄糖批发酵接近。同时，杆菌肽以29 U/(mL·h)的速率持续合成至40 h的1 143 U/mL，比分批发酵效价提高了19%。

地衣芽孢杆菌；杆菌肽；葡萄糖；乳糖；溢流代谢

杆菌肽具有抗菌谱广泛，排泄短，药物残留量少，安全评估性好，无抗药性等优良特性，是目前世界上销量最大的畜禽用抗生素之一[1-3]。杆菌肽特有的优势使其应用和研究得到了迅速发展，如：曾新年等[4]基于地衣芽孢杆菌杆菌肽发酵前期(4 h)溶氧跌零，考察了发酵中期流加H2O2对细胞生长代谢的影响，降低了细胞自溶度，增加了糖耗速率，效价达到1 021 U/mL，比对照提高了10%。鲍帅帅等[5]研究了谷氨酸对杆菌肽合成的影响，谷氨酸增加了还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)的消耗，降低了挥发酸的生成，放罐效价达到1 020 U/mL，发酵周期缩短约4 h。WANG等[6]研究了乙偶姻还原酶的活性对地衣芽孢杆菌合成杆菌肽的影响，发现提高该酶活性可以明显减低胞内NADH/NAD+的比率，最高效价达到1 076 U/mL，比对照提高了11.6%。

葡萄糖是芽孢杆菌补料批培养常用的碳源，如：葡萄糖和有机氮源混合补料策略[7]；葡萄糖、氨基酸和磷酸盐补料策略[8]，但是关于杆菌肽发酵补糖优化的报道却不多。因此，笔者研究了补料碳源(葡萄糖和乳糖等)对细胞生长以及溢流代谢和杆菌肽合成的影响，探寻速效碳源和迟效碳源在发酵过程中的作用机制差异，为工业化应用打下基础。

1 材料与方法

1.1菌株

地衣芽孢杆菌LC(BacilluslicheniformisLC)为高产杆菌肽菌株，产生丰富的淀粉酶、蛋白酶等，生长繁殖迅速，由湖北大学绿康生物工程研究所提供。

1.2培养基

茄子瓶斜面培养基：酵母浸膏20 g/L， NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L，调pH至7.5。

种子培养基：豆粕50 g/L，玉米淀粉20 g/L，轻质CaCO34 g/L，(NH4)2SO41 g/L，玉米浆2.5 g/L。

发酵培养基：豆粕90 g/L，淀粉40 g/L，CaCO34 g/L，(NH4)2SO40.7 g/L，蛋白胨10 g/L。

1.3培养方法

1.3.1 种子活化

用无菌竹签转接-80 ℃保藏甘油管菌液至茄子瓶斜面，在恒温培养箱中37 ℃培养24 h。

1.3.2 种子培养

向长满菌苔的茄子瓶斜面中加50 mL无菌水，用竹签刮洗菌苔后倒入装有玻璃珠的无菌空三角瓶中，摇匀。取4 mL菌悬液于种子摇瓶中(250 mL三角瓶装25 mL种子培养基)，并在37 ℃、200 r/min培养24 h，得到种子液。

1.3.3 摇瓶发酵

取3 mL菌悬液于发酵摇瓶(250 mL三角瓶装25 mL发酵培养基)，并在37 ℃、200 r/min培养约46 h。

1.3.4 10 L罐发酵

基料5 L，接种量的体积分数为10%，通气量450 L/h，转速450 r/min，37 ℃培养40 h左右。

1.3.5 葡萄糖溶液的流加

周期取样，采用DNS法测定发酵上清液中葡萄糖含量，及时调整罐上补料控制系统的参数，包括补料频率和开度参数，控制15%葡萄糖溶液流加速率，使发酵液中葡萄糖质量浓度在20～28 h维持在7～10 g/L之间。

1.4分析方法

1.4.1 总糖和葡萄糖的测定

采用硫酸蒽酮法测定总糖[9]。DNS法测定葡萄糖的含量[4]。

1.4.2 杆菌肽效价测定

流动相配制：配制pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液，甲醇∶乙腈∶磷酸盐缓冲溶液的体积比为64∶1∶35。

检测条件：Ultimate 3000高效液相色谱；AclaimTM的C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长254 nm；柱温30 ℃，流速1 mL/min；进样量为25 μL。

精密称取15 mg杆菌肽标准品(效价为65.8 U/mg)，用40 g/L的EDTA溶液溶解并定容5 mL，上清液用0.22 μm的微孔滤膜过滤，滤液为杆菌肽标品溶液，其效价为197.4 U/mL。经高效液相色谱测定，获得该标品的峰面积(As)。

将5 mL发酵液样品在8 000 r/min离心10 min，取上清液。取1 mL上清液并加入50%乙醇溶液定容至5 mL(相当于稀释5倍)，置磁力搅拌器上搅拌5 min，以10 000 r/min离心5 min，取上清液用0.22 μm的微孔滤膜过滤，滤液用于高效液相色谱测定，获得样品的杆菌肽峰面积A。杆菌肽效价(U/mL)=5×197.4×A/As。

1.4.3 离线测定挥发性有机酸含量

检测条件：安捷伦7890B型，氢火焰离子化FID检测器。HP-INNOWax 型毛细管柱(30 m×0.53 mm×1 μm)；程序升温条件：40 ℃保留5 min，后以20 ℃ /min升到120 ℃，再以10 ℃ /min 升到220 ℃，220 ℃ 保留3 min。分流比是15∶1，流速 5 mL/min，进样口温度250 ℃，检测器温度280 ℃。

2 结果与分析

2.110L发酵罐批次培养地衣芽孢杆菌LC的发酵特点

发酵过程乙偶姻、乙酸、丙酸、异丁酸含量的变化趋势图1B所示：乙偶姻和丙酸的趋势一致，12～16 h开始积累，分别达到最大值为1.66 g/L和0.97 g/L，28 h被消耗殆尽；异丁酸质量浓度20 h达到最大的1.98 g/L，并在32 h被消耗殆尽。乙酸24 h的峰值质量浓度3.42 g/L，比其他挥发酸醇高。这与地衣芽孢杆菌LC发酵生产杆菌肽过程中，细胞通过溢流代谢产生挥发性有机酸醇来维持NADH/NAD+代谢平衡[11]的报道一致。

图1 地衣芽孢杆菌LC杆菌肽发酵过程(数据为平均值±标准偏差)Fig.1 Time course of bacitracin fermentation byB.licheniformis LC (Means±standard deviation)

2.2变速流加15%的葡萄糖对杆菌肽合成的影响

发酵24 h后发酵液中总糖浓度降到2%以下(图2A)，发酵液中碳源不足影响了菌体活性和杆菌肽的合成效率。由于24～32 h总糖维持在9 g/L左右，维持杆菌肽的合成效率(图1A)。因此，通过蠕动泵变速流加15%葡萄糖溶液，使20～28 h发酵液还原糖质量浓度维持在7～10 g/L之间，以考察流加葡萄糖对菌体的生长和代谢活性的影响。

如图2A所示：16 h的葡萄糖质量浓度为6.3 g/L，于是在20～28 h启动流加模式。12～20 h，菌体生长和杆菌肽合成与对照组相差无几；流加葡萄糖后，20～40 h杆菌肽合成速率仅为17.2 U/(mL·h)，是补料前(12～20 h)合成速率32.3 U/(mL·h)的53%，40 h达到峰值701 U/mL，仅为对照组的73%，随后开始降解。

24 h峰值生物量为115×108CFU/mL，比对照组峰值提高26%。同时，36 h出现明显的二次生长现象，生物量93×108CFU/mL。42 h放罐pH 8.25，低于对照的8.51，进一步反映了葡萄糖的流加增加了碳代谢供给，促进了发酵后期细胞的生长，减少了自溶和氮源的脱氨基催化。

图2 流加葡萄糖对杆菌肽发酵过程的影响(数据为平均值±标准偏差)Fig.2 The effect of glucose-feeding on bacitracin fermentation by B.licheniformis LC (Means±standard deviation)

图2B所示：乙偶姻、丙酸(16 h)和异丁酸(20 h)的峰值浓度是1.75 、1.1 和2.06 g/L，与对照组相(图1)近。之后乙偶姻和丙酸分别在24 h和28 h出现二次峰值，为1.52 和0.65 g/L。乙酸在28 h的峰值为4.41 g/L，36 h仍高位维持在2.57 g/L。葡萄糖的流加明显增加了挥发性有机酸醇的含量，直到40 h才消耗殆。

显然，葡萄糖溶液的流加，导致初级代谢旺盛，而次级代谢减弱，杆菌肽合成受到抑制，对发酵产生了不利的影响。因此，需要考察添加迟效碳源来减弱碳通量，避免葡萄糖流加带来的负面影响。

2.3添加不同种类的碳源对杆菌肽合成的影响

由图1和图2所示：杆菌肽发酵中后期，碳源是不足的，而且流加葡萄糖对杆菌肽合成也没有正效果。因此，需要考虑添加迟效碳源，当细胞处于糖限制状态时，补加的迟效性碳源能持续地为细胞供应能量和前体，可能会促进杆菌肽分子持续合成。

葡萄糖和乳糖的混合碳源发酵表现为细菌碳分解代谢阻遏效应，乳糖作为迟效性碳源可以在细胞处于糖限制状态时，持续地为细胞供应能量和前体。甘油作为细菌常用的碳源，因其跨膜转运效率远低于葡萄糖[12]，可能也起到迟效碳源的作用。另外，PW310是水溶性酵母葡聚糖，以具有β-1，3糖苷键为特征[13]。地衣芽孢杆菌菌株具有产生葡聚糖酶的能力[14]。因此，当细胞处于糖限制状态时，存在的PW310可能会诱导细胞产生葡聚糖酶，并持续的为细胞供应碳源，可能也会促进杆菌肽的合成。乙酸是细菌常见的溢流代谢产物，并可被重新利用(图2)。直接流加乙酸会对发酵液pH影响显著，因此，添加乙酸钠可能会在发酵后期碳源不足时用于菌体的生长和代谢，并促进杆菌肽的合成。基于以上考虑，我们在摇瓶水平上研究了4种不同类型的碳源(乳糖、甘油、乙酸钠和可溶性葡聚糖PW310)对细胞杆菌肽合成的影响，如图3所示。

图3 碳源添加对杆菌肽合成的影响(平均值±标准偏差)Fig.3 Effects of carbon resource addition on bacitracin producion (Means±standard deviation)

当乳糖添加量为1.5%时，杆菌肽效价最高为725 U/mL，比对照组(660 U/mL)提高了9.84%。添加量0.5%、1.0%和2.0%都促进了杆菌肽合成，但是不如1.5%的明显。说明乳糖做为迟效性碳源，其在葡萄糖耗尽后能持续、温和地为细胞提供碳源和能源，并最终促进了杆菌肽的合成。

添加甘油对杆菌肽合成发生抑制作用，而且浓度越高，抑制作用越明显。甘油加入摇瓶后增加了培养基的黏度，引起发酵环境渗透压和供氧效率的改变，摇瓶发酵结束时，pH值在7.3～7.4，远低于对照摇瓶pH在8.0～8.1的水平(资料未显示)并呈现出其对杆菌肽的抑制效应。后续研究可以考虑流加的方法考察其对细胞生长代谢的影响。

添加酵母可溶性葡聚糖PW310时，会抑制杆菌肽的合成，且浓度越高，抑制作用越明显。这可能与酵母葡聚糖的糖苷键为β-1,3-1,6型[13]，与地衣芽孢杆菌的葡聚糖酶(β-1,3-1,4糖苷键型)[14]专一性不匹配有关。另外，PW310为安琪酵母股份有限公司生产的的水溶性产品，其1.5%～2.0%的水溶液pH值在pH 4.5～5.0之间，加入培养基后改变了发酵的初始pH值，这影响了细胞的生长和代谢，并对杆菌肽合成产生了抑制作用。后续研究可以考虑在发酵罐上采用PW310溶液调pH至中性后流加的方法，考察其对细胞生长代谢的影响。

当乙酸钠添加量为1.0%时，杆菌肽效价最高为688 U/mL，比对照略有提高，而1.5%和2.0%添加量对杆菌肽合成表现出抑制作用。乙酸可以经乙酸激酶-磷酸转乙酰酶生成乙酰-CoA[15]进入三羧酸循环而被利用，而1分子外源乙酸根的活化需要额外消耗1分子的ATP，这可能加重了细胞的供能负担；另外在葡萄糖限制条件下，由于糖酵解途径的下调导致草酰乙酸的回补效率下降可能也会导致乙酰CoA进入三羧酸循环代谢的效能降低，而且外源乙酸钠添加浓度越高(如1.5%的添加量)，这种矛盾就越明显，能量供应不足影响了杆菌肽分子前体——氨基酸的活化，并最终对杆菌肽合成产生了抑制作用，而且显示出高外源乙酸浓度抑制相关性。

基于以上分析，初步确定了乳糖对杆菌肽发酵合成的促进作用，因此选择乳糖进行后续实验，而甘油和PW310将在以后的研究中分别在发酵罐上采用流加和中性pH流加的策略加以展开，以确定其对细胞的生长、代谢以及杆菌肽合成的影响。

2.410L罐基料添加1.5%乳糖对细胞生长和杆菌肽合成的影响

根据细菌对葡萄糖和乳糖的利用方式[16]，乳糖可以在基础料中添加以简化发酵补料工艺，其对地衣芽孢杆菌LC生长和代谢的影响如图4所示。

图4 10 L罐基料添加1.5%乳糖对细胞生长和杆菌肽合成的影响Fig.4 Effects of lactose addition (1.5%) on cell growth and bacitracin production in 10 L bioreactor

如图4A所示：菌体峰值生物量(32 h)110×108CFU/mL，比对照组(91×108CFU/mL，图1)提高20.6%，36 h细胞自溶近一半。40 h也出现了二次生长，其生物量为104×108CFU/mL，之后细胞再次自溶。

基料添加乳糖后，杆菌肽效价持续合成至40 h的1 143 U/mL，比对照组的峰值效价(960 U/mL，图1A)提高19%。同样的，pH呈现持续上升的趋势，增长速度和流加葡萄糖实验组(图2)相当，42 h放罐pH 8.27。

添加乳糖后，乙偶姻、丙酸、异丁酸的浓度在20 h积累至一次峰值，分别是2.09、1.83和3.51 g/L(图4B)。28 h挥发性有机酸醇的含量二次积累。发酵后期溢流分子作为主要储备碳源，维持细胞的生长，并在40 h彻底地消耗殆尽。乙酸是含量最多的溢流代谢产物之一，它与其他挥发酸醇的含量变化趋势不同，12～32 h乙酸质量浓度维持在3.62～4.73 g/L之间，它的代谢时间明显要比其他挥发酸醇要长，是后期碳源不足时主要的氧化供能分子，这和KABISCH等[17]的报道一致。

3 讨论与结论

3.1讨论

地衣芽孢杆菌LC高密度发酵生产杆菌肽的过程中，存在溢流代谢(图1B，图2B和图4B)和溢流物质被重新利用的现象，这是芽孢杆菌碳分解代谢阻遏的具体表现形式[18]。VOIGT等[19]通过蛋白质组学研究了衣芽孢杆菌的生理状态，也确定只要培养过程中有足够的葡萄糖，以乙酸为主要代表的溢流代谢产物就会大量合成。DAUNER等[15]发现，枯草芽孢杆菌在葡萄糖消耗殆尽后，乙酸可以经乙酸激酶-磷酸转乙酰酶生成乙酰-CoA进入三羧酸循环而被利用。另外，图1(20～24 h)、图2(24～28 h)和图4(28～32 h)中，当乙偶姻含量下降时，乙酸却在积累，说明该周期内可能存在乙偶姻向乙酸的转化，这与WIEGAND等人[20]关于地衣芽孢杆菌中存在乙偶姻→乙酰-CoA→乙酰磷酸→乙酸代谢途径的报道一致。

葡萄糖溶液的流加，主要促进了菌体生长，导致初级代谢旺盛，而杆菌肽合成受到抑制，对发酵产生了不利的影响。SILVA等[21]利用流式细胞仪进行了地衣芽孢杆菌的代谢组学分析，揭示了碳源种类、末端代谢产物对细胞的生理状态的影响。在含有乳糖和葡萄糖作为碳源的培养中，细胞代谢活力和膜完整性好于只含葡萄糖的对照组。

基料添加乳糖(1.5%)也影响了挥发性有机酸醇的代谢，迟效碳源-乳糖的添加虽然没有消除细胞自溶(32 h，图4A)，但是自溶时间比对照(28 h，图1A)延后了4 h，也比流加葡萄糖(24 h，图2A)延后了8 h。溢流分子明显地促进了细胞在发酵后期的二次生长，细胞利用混合碳源的生长过程比对照延长了12 h(图4A)，而且杆菌肽合成时间延长了8 h(对照为32 h，图1A)。乳糖代谢后生成的葡萄糖和半乳糖在发酵中后期被利用，同样产生溢流代谢，而且24 h乙酸浓度的回升是乳糖开始被利用的信号。说明在后期碳源不足时，乙酸作为碳源、能源储备分子用于菌体生长代谢而发挥重要功能。

3.2结论

研究了混合碳源对地衣芽孢杆菌LC生长、代谢特征和对杆菌肽合成的影响，具体结论如下：

(1)地衣芽孢杆菌LC高密度发酵生产杆菌肽的过程存在碳代谢阻遏效应，溢流分子作为储备碳源在发酵中后期被重新利用。

(2)发酵中后期菌体自溶和杆菌肽降解是由碳源不足造成的，而且乙酸是杆菌肽发酵后期主要的供能分子，这为下一步基于pH的补料工艺优化提供了明确的窗口信息。

(3)发酵中期流加葡萄糖促进了细胞二次生长和溢流分子的产生，却抑制杆菌肽的合成效率，葡萄糖不是杆菌肽补料发酵的最适碳源。

(4)基料添加乳糖(1.5%)延长细胞的生长周期、维持了杆菌肽的合成速率，显著提高了杆菌肽的效价，是更有利于杆菌肽合成的补料碳源。

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EffectsofthemixedcarbonresourceadditiononbacitracinbiosynthesisbyBacilluslicheniformis

LIU Dao-qi1,CHEN Shou-wen2,LI Jun-hui3,CHEN Xiong1,WANG Zhi1*

1(Key Laboratory of Engineering (Ministry of Education),Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China) 2(College of Life Sciences,Hubei University,Wuhan 430062,China) 3(Lifecome Biochemistry Co.LTD.,Pucheng 353400,China)

The effects of batch culture and glucose/lactose fed-batch culture on cell growth and bacitracin production byB.licheniformiswere studied in 10 L bioreactor. In the process of batch culture (the control), the maximum biomass and bacitracin production was 91×108CFU/mL at 28 h and 960 U/mL at 32 h, respectively. Glucose-fed batch culture from 20 h to 28 h facilitated the second growth, the peak biomass was 115×108CFU/mL at 24 h, which was 26% higher than that of the control. Nevertheless, the bacitracin synthesis efficiency was 17.2 U/(mL·h), which was only 53% of that before glucose feeding. Lactose addition in the production medium enhanced the maximum biomass to 110×108CFU/mL at 32 h, which was 20.6% higher than that of the control and was nearly the same as that of the glucose-fed batch culture. Meanwhile, bacitracin synthesis efficiency was maintained at 29 U/(mL·h) to 40 h, thus elevating bacitracin production to 1 143 U/mL that was 19% higher than the control.

Bacilluslicheniformis；bacitracin；glucose；lactose；overflow metabolism

硕士研究生(王志副教授为通讯作者，E-mail:476462848@qq.com)。

2017-03-07，改回日期：2017-05-24

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014242