基于高通量测序技术的不同性状窖泥微生物组成研究

罗雯，张倩颖，廖作敏，张文学,2*

1(四川大学 轻纺与食品学院，四川 成都，610000) 2(四川大学 锦江学院白酒学院，四川 眉山，620860)

基于高通量测序技术的不同性状窖泥微生物组成研究

罗雯1，张倩颖1，廖作敏1，张文学1,2*

1(四川大学 轻纺与食品学院，四川 成都，610000) 2(四川大学 锦江学院白酒学院，四川 眉山，620860)

借助高通量测序技术，探讨了新泥、趋老熟、老熟、趋老化、老化等不同性状窖泥的微生物群落结构组成。结果显示，趋老熟和老熟窖泥微生物群落的多样性和丰富度均高于其他3种窖泥，且2者的群落分布特征比较相似。趋老熟、老熟窖泥中梭菌属(Clostridium)的优势较为明显，分别为总水平的17.55%和2.99%，而新泥、趋老化泥、老化泥中则以假单胞菌属(Pseudomonas)为绝对优势菌属，占总水平的69.68%、70.50%和72.84%。该研究初步揭示了不同性状窖泥的微生物群落结构差异，为研究判断窖泥性状的微生物组成提供了参考。

高通量测序；不同性状；窖泥；微生物组成

窖泥是微生物生长繁殖的载体。在浓香型白酒的酿造过程中，窖泥微生物不断进行自然选择与淘汰，最终形成其特有的微生态环境[1]。窖泥微生物对白酒风味物质的形成和各风味成分量比关系的协调具有重要作用[2-3]。研究发现，不同窖龄的窖泥微生物结构差异较大[1]，同一窖池不同部位的微生物组成也有所不同[4]。

岳元媛[5]等人通过传统方法对泸州老窖窖泥微生物进行分离鉴定，发现了芽孢杆菌属(Bacillus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)及梭菌属(Clostridium)的存在。但是，有研究发现，自然环境中可培养的微生物只有0.1%～10%[6]，并且由于窖泥特有的理化性质以及窖泥中厌氧菌大量存在，进一步阻碍了窖泥微生物的分离与鉴定，因此利用微生物纯培养技术难以客观揭示窖泥微生物的多样性。吴冬梅[7]利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术可视化表征了窖泥微生物，但是，窖泥特有的腐殖酸等杂质极大地影响了FISH技术的可视化效果，同时，窖泥厌氧菌的生理特性和窖泥对微生物的吸附性导致了定量结果的不精确性。随着分子生物学的迅速发展，陶勇[8]等利用变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技术研究了剑南春不同窖龄窖泥，发现窖泥中的优势微生物主要分布在厚壁菌门。目前，对不同窖龄窖泥中活性微生物演替规律研究较多[8-10]，对不同性状窖泥微生物群落结构差异研究较少。高通量测序技术以其成本低、通量高、信息丰富等特点普遍应用于土壤微生物群落结构研究[11]，但是用于窖泥中较少。本研究通过高通量测序技术，研究了新泥、趋老熟、老熟、趋老化、老化5种不同性状窖泥样品的微生物群落组成，并通过对比不同性状窖泥中优势微生物，为研究影响窖泥质量的微生物指标提供了参考。

1 材料与方法

1.1材料

窖泥样品：取自四川某知名浓香型白酒生产厂，为了保证窖泥性状判定的准确性，窖泥性状结合白酒生产实践，根据感官和酒厂员工经验判定。选取5种不同性状窖泥(新泥、趋老熟泥、老熟泥、趋老化泥、老化泥)进行研究。窖泥样品为窖底四角和中心取样，并充分混合。-80 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.2高通量测序

1.2.1 基因组 DNA 的提取及检测

用 Omega土壤试剂盒提取样品中微生物基因组 DNA，具体提取步骤参见操作说明书。提取后置于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR扩增以及Illumina MiSeq测序

细菌 16S rDNA 的扩增采用引物 520F(5’-barcode+ GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG-3’)和802R(5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’)。扩增完成后，对PCR产物进行定量。Illumina MiSeq测序委托上海派森诺生物科技有限公司进行。

1.2.3 高通量数据分析

利用Flash软件[12]连接整合过的双端序列。根据 barcode回归样本，再运用Qiime软件[13]剔除疑问数列，并对剩下的数列进行统计与分析。为了使操作分类单元(OTU)的分析结果更为可靠，去除丰度值低于全体样本测序总量0.001%的OTU[14]。

为了对比不同窖泥样品中微生物的多样性，使用Qiime软件对测序结果进行分析，得出反映微生物群落丰富度的Chao1指数[15-16]和ACE[17]指数，以及反映物种多样性的Shannon[18-19]指数和Simpson[20]指数。利用HemI软件分析不同水平上样品间优势微生物的差异性。

2 结果与讨论

2.1窖泥样品操作分类单元(OTU)分析

另外，就辐射广度而言，“绿色原则”相较于将其作为规制民事权利行使的手段，也更显优势。《民法总则（草案）》（三次审议稿）第133条在解释上仅对权利行使发生作用，对其他领域，如权利产生（法律行为效力评价）不发生作用。［8］69《民法总则》在将“绿色原则”提升为基本原则地位之后，预示着该项原则的精神和理念可覆盖民法全部领域。

对窖泥样品在不同水平上的操作分类单元进行统计，结果见表1。除了种水平外，其他各分类水平上检测到OTU数变化趋势为：新泥转变为趋老熟泥过程中，OTU数逐渐增加，到趋老熟时OTU达最大值，其后转变为老熟、趋老化、老化性状窖泥过程中，OTU持续减少。

表1 不同窖泥样品在不同分类水平下高通量测序的OTU数

而在种水平上，趋老熟泥OTU最多，趋老化泥次之，而新泥中检测到的OTU数多于老熟泥和老化泥，老化泥中的OTU数最少。在未分类微生物中，老化泥OTU数最多，推测是人们尚不了解的某些微生物在与优势菌的竞争中数量不断增多，这些未知性状微生物的存在和繁衍导致了窖泥老化。

2.2窖泥样品菌群Alpha多样性分析

2.2.1 稀疏曲线

对测序序列进行随机抽样，利用抽中的序列及其对应的OTU数绘制稀疏曲线[21-22](图1)。图1表明，随着测序序列的增加，五个样品的稀疏曲线趋于平缓，表明现有的测序数据量已足以反映样本及微生物多样性，无需再增加测序深度。趋老熟泥中微生物的多样性最丰富，老熟泥次之，而老化窖泥微生物多样性最低。稀疏曲线的变化趋势与窖泥样品在门、纲、目、科、属5个水平上OTU数的变化趋势一致，说明了趋老熟窖泥中物种的多样性最为丰富。

A-新泥;B-趋老熟泥;C-老熟泥;D-趋老化泥;E-老化泥图1 五个窖泥样品OTU数的稀疏曲线Fig.1 Rarefaction curve of OTUs in pit mud

2.2.2 窖泥样品中微生物群落多样性指数

窖泥中原核生物的组成较为复杂，为了对比不同窖泥样品中微生物的丰富度和多样性，根据测序结果计算得出Chao1 指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数。结果见表2。

表2 五种窖泥样品中微生物群落多样性指数

根据表2可见，趋老熟窖泥样品的chao1指数为900.00，ACE指数为1 000.17；而老熟窖泥样品chao1指数为480.00，ACE指数为554.77。表明趋老熟窖泥样品群落的丰富度最高、老熟泥次之，而老化泥的群落丰富度最小。根据反映物种多样性的Shannon指数和Simpson指数可知，5种不同性状的窖泥样品中，趋老熟泥的微生物群落多样性最高，然后依次为老熟泥、新泥、趋老化泥，而老化泥的群落多样性最低。多样性指数变化趋势与除种以外的不同分类水平下OTU数走向一致，即在5种不同性状窖泥中，趋老熟窖泥微生物丰度最高、种类最丰富，而老化窖泥物种多样性最低，说明趋老熟、老熟窖泥中的微生物经过长时间的自然选择与驯化，已适应白酒酿造的特殊环境，因此，可以认为老熟、趋老熟泥中酿酒功能微生物也多于其他3种泥。

2.3窖泥样品菌群的分类组成分析

在门、纲、目、科、属、种6个不同分类水平下，不同窖泥样品含有的微生物类群数量见表3。无论哪种分类水平上，均显示出趋老熟窖泥微生物类群数最多，老化泥最少。5个样品共检测到56个门，其中新泥36个、趋老熟泥38个、老熟泥29个、趋老化泥31个、老化泥23个。对门水平上各样品的优势菌门(>1%)进行统计，结果见表4。

表3 窖泥样品在各分类水平的微生物类群数

表4 窖泥样品门水平优势菌种

根据表4，趋老熟窖泥中有10个优势菌门，其中，厚壁菌门(46.70%)和拟杆菌门(11.03%)含量较高。而老化泥的优势菌门数量最少，只有变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门3个优势菌门，其中以变形菌门占有绝对优势(93.78%)。说明老化窖泥中微生物多样性较为单一，与2.2.2反映物种多样性的Shannon指数和Simpson指数趋势一致。

利用HemI软件对表4进行分析，结果表明，各样品只在变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门3个微生物菌门存在明显差异(图2)。对这3种含量差异较大的优势菌门进行分析(见图3)。

A-新泥;B-趋老熟泥;C-老熟泥;D-趋老化泥;E-老化泥图2 不同性状窖泥样品优势菌门含量差异Fig.2 Dominant microorganism of the samples at the phylum level

图3 不同性状窖泥样品门水平差异较大的优势菌含量Fig.3 Obviously dominant microorganism in different traits of pit mud at the phylum level

结果表明，趋老熟和老熟泥中厚壁菌门(46.70%、73.11%)和拟杆菌门(11.03%、11.32%)明显多于新泥、趋老化泥、老化泥，而在新泥、趋老化泥、老化泥中，变形菌门(89.55%、92.53%、93.78%)为绝对优势菌。根据图3，可以将本次取样的窖泥样品分为两大类：以变形菌门为主的新泥、趋老化泥、老化泥；以厚壁菌门和拟杆菌门为主的趋老熟泥、老熟泥。由此推测质量较好的泥中厚壁菌门较多而变形菌门较少。胡晓龙[23]在研究不同质量窖泥时，发现优质窖泥中，以厚壁菌门(31.16%)和拟杆菌门(27.51%)为优势菌门，与本文研究结果一致。王明跃[24]等人在研究20、50、150年窖龄窖泥样品时发现优势菌门依次为厚壁菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门，其中，厚壁菌门为绝对优势微生物，而变形菌门所占比例较小，说明20、50、150年3个窖龄的窖泥样品质量相对较好，性状接近本研究中的趋老熟、老熟泥，因此并未检测到大量的变形菌门。有研究认为，厚壁菌门中含有某些功能型微生物，能代谢产生乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸以及浓香型白酒中主要的香味成分己酸乙酯，拟杆菌门作为趋老熟、老熟窖泥样品中的第二大优势菌门，能够发酵葡萄糖产生相应的有机酸[25-26]。

在目水平，所有窖泥样品共检测到原核微生物中217个目。其中优势菌目有17种，含量占总体原核生物的87.8%。对差异较明显的优势微生物进行分析，结果见图4。

图4 不同性状窖泥样品目水平差异较大的优势菌含量Fig.4 Obviously dominant microorganism in different traits of pit mud at the order level

新泥、趋老化泥、老化泥中微生物主要为假单胞菌目(Pseudomonadales)和根瘤菌目(Rhizobiales)，分别占整个原核生物的75.12%～78.32%、7.97%～9.44%，而趋老熟、老熟泥则只占了0.39%～1.11%和0.33%～1.06%。趋老熟、老熟窖泥样品中的优势菌目主要为梭菌目(Clostridiales)和拟杆菌目(Bacteroidales)，其中梭菌目分别为37.39%、17.52%，拟杆菌目为10.99%、11.19%。胡晓龙[23]在研究不同质量窖泥时，发现梭菌目、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、拟杆菌目、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)为优质窖泥中的优势微生物；梁会朋等用PCR-DGGE方法发现梭菌目为泸州老窖老熟窖泥中优势菌目，而泸州老窖窖香和部分挥发性成分与梭菌目中的某些微生物的作用密不可分[27]。结合本研究成果，推测梭菌目是保证窖泥质量的基础。

属水平，5种不同性状的窖泥样品共检测到614属。对每个窖泥样品中核心属(含量大于1%)进行分析，发现共有34个核心属(图5)，集中于8个门。其中，5个窖泥样品在假单胞菌属(Pseudomonas)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、梭菌属(Clostridium)存在明显差异。在质量较好的趋老熟泥和老熟泥中，梭菌属优势较为明显，分别占总水平的17.55%、2.99%。而在新泥、趋老化泥、老化泥中，假单胞菌属、苍白杆菌属的优势最为明显，分别占总水平的69.68%～72.84%、6.58%～8.55%。有文献报道，梭菌为浓香型白酒生产工业中最重要的功能菌，在厌氧条件下能将有机物转化为有机酸，并在酶催化反应或者非酶催化反应下，与醇反应，生成丁酸乙酯和己酸乙酯[28-20],即浓香型白酒中重要的呈味物质。根据已有的文献报道，在窖泥环境中，克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)与甲烷菌(Methanogens)发生共同作用，将醇转化为乙酸、丁酸、己酸；而永达尔梭菌(ClostridiumLjungdahlii)能将CO、H2转化乙醇和乙酸乙酯[3-,32]。而关于窖泥老化与假单胞菌属关系的报道较少，有待进一步研究。

图5 窖泥样品中优势微生物属水平组成Fig.5 Dominant microorganism of the pit mud samples at the genus level

3 结论

不同性状窖泥的微生物群落结构差异较大。本文通过高通量测序技术探究五种不同性状窖泥的微生物群落结构，发现新泥、趋老化泥及老化泥中微生物的分布特征较为相似，而老熟泥和趋老熟泥规律比较一致。质量较好的老熟、趋老熟窖泥中，梭菌属为主要优势菌群。而质量一般或者质量较差的新泥、趋老化窖泥、老化窖泥中假单胞菌属含量较高。

窖泥中含有丰富而复杂的微生物群落组成，通过高通量测序技术能够克服传统方法的局限性，更简单高效地解析窖泥微生物群落结构，了解主要优势菌的演变规律，对窖泥中微生态结构变化的分析具有重要意义，有利于更好地指导生产实践，做好养窖和护窖工作，生产更多优质浓香型白酒。

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Researchonmicrobialcompositionofpitmudwithdifferenttraitsusinghigh-throughputsequencing

LUO Wen1,ZHANG Qian-ying1,LIAO Zuo-min1,ZHANG Wen-xue1,2*

1(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610000,China) 2(School of Liquor-making Engineering,Jinjiang College,Sichuan University,Meishan 620860,China)

In order to explore the microbial community structure of pit mud with different traits, microbial compositions of five kinds of pit mud including new pit mud, tending to be aged pit mud, aged pit mud, tending to be aging pit mud and aging pit mud were studied herein by using high-throughput sequencing. The results showed that the distribution characteristics of microbial community in tending to be aged and aged pit muds were similar. Besides, the diversity and abundance of microbial communities in those two pit muds were higher than that in other pit muds.Clostridiumwas the predominant genera in tending to be aged and aged pit muds, which was 17.55% and 2.99%, respectively. While Pseudomonas was the predominant genera in new, tending to be aging and aging pit muds, accounting for 69.68%, 70.50% and 72.84%. This research preliminarily revealed the microbial community structure of pit mud with different traits, which provided a reference for studying microbial pointers to determine the properties of pit mud.

high-throughput sequencing；different traits；pit mud；microbial composition

硕士研究生(张文学教授为通讯作者，E-mail：foodbiotech@126.com)。

国家自然科学基金(31571824)

2017-05-15，改回日期：2017-05-31

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014763