灵芝多糖对多柔比星诱导心肌细胞损伤保护作用的研究

徐 繁, 李 潇, 刘兰芳, 潘兴华, 张 力, 张圣林, 林萍萍, 李青山

(1.承德医学院附属医院, 河北 承德 067000 2.解放军昆明总医院干细胞工程实验室， 云南 昆明 650000)

灵芝多糖对多柔比星诱导心肌细胞损伤保护作用的研究

徐 繁1, 李 潇1, 刘兰芳1, 潘兴华2, 张 力1, 张圣林1, 林萍萍1, 李青山1

(1.承德医学院附属医院, 河北 承德0670002.解放军昆明总医院干细胞工程实验室， 云南 昆明650000)

目的研究灵芝多糖对多柔比星所致心肌损伤的保护作用，探讨多柔比星对心肌细胞损伤的机制。方法将不同浓度多柔比星(1、2、4、6μmol/L)与H9C2心肌细胞共培养6、12、24h，计算不同作用时间及药物浓度的细胞抑制率；将H9C2心肌细胞与不同质量浓度(0，3.125，6.25，12.5，25mg/L )的灵芝多糖共培养，1h后加入多柔比星，24h后观察细胞形态变化，并计算细胞抑制率；将灵芝多糖与MCF-7，KB，K562共培养24h，1 h后加入多柔比星，48h后计算细胞生长抑制率。结果2μmoL/L多柔比星与心肌细胞共培养24h的细胞抑制率最高，25mg/L灵芝多糖可明显降低多柔比星诱导的心肌细胞死亡，且不降低药物抗肿瘤作用。结论灵芝多糖对心肌细胞具有直接保护作用，且不减弱多柔比星抗肿瘤作用。

灵芝多糖; 心肌细胞; 多柔比星

多柔比星具有广谱抗肿瘤作用，但其对正常细胞(心脏、肝脏、肾脏等细胞)具有毒性作用，严重制约多柔比星的临床应用，其中最严重的是剂量依赖性心脏毒性，且临床上尚无有效口服药物减轻此药物毒性。灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides，GL-PS)是灵芝的主要活性药效成分之一，具有抗自由基、免疫增强和抗肿瘤作用。有相关研究表明，灵芝多糖具有对抗心肌细胞损伤，从而保护心血管的作用[1]。本研究说明GL-PS对心肌细胞具有直接保护作用，且不减弱多柔比星抗肿瘤作用。

1 实验试剂

盐酸多柔比星注射液购于山西普德药业股份有限公司，灵芝多糖购于北京康泰合元生物公司，DMEM完全培养基、胎牛血清、MTT为Gibco公司产品。大鼠心肌细胞H9C2、人红白血病细胞 K562、人口腔上皮癌细胞 KB、人乳腺癌细胞MCF-7 由中国科学院细胞库提供。

2 方 法

2.1不同浓度多柔比星不同时间对心肌细胞的影响:将H9C2细胞置于DMEM培养液(含10%胎牛血清)中培养，待细胞稳定并90%融合时加入0.25%胰酶消化，待细胞变形立即加入总体积10%胎牛血清终止消化，弃上清，调整细胞密度为1×104个，接种于96孔培养板内，并加入分别含多柔比星浓度分别为1、2、4、6μmoL/L的培养液，其中未经多柔比星处理的细胞为空白中，经药物处理的细胞为给药组，并将其共同置于培养箱中培养6、12、24h，取出后用MTT法在酶标仪上波长550nm处进行光密度定量检测，以测得的光密度值(OD)反映细胞活性和数量的多少。细胞抑制率(%)=(空白组OD-给药组OD)/空白组OD×100%。

2.2心肌细胞培养及给药:将H9C2细胞在96孔板中培养稳定，24h后加入不同质量浓度(0，3.125，6.25，12.5，25mg/L )的GL-PS，1h后加入最适浓度多柔比星(最适浓度根据本实验方法2.1得出)，仅含GL-PS的细胞作为对照组；仅含多柔比星，不含GL-PS的处理组作为模型组；同时含有两种药物的为干预组。培养24h后，用 MTT 法在波长550 nm处测定吸光度值表示细胞活力。细胞抑制率按以下公式计算：细胞抑制率(%)=(对照组OD-模型组或干预组OD)/对照组OD×100%。

2.3肿瘤细胞培养及给药:为了评价GL-PS对多柔比星抗肿瘤活性的影响，分别将三株人源肿瘤细胞MCF-7，KB ，K562接种于96孔板上，每孔细胞量2×103个。24h后加入不同质量浓度(0，3.125，6.25，12.5，25mg/L )的GL-PS，1h后加入多柔比星(根据方法2.1得出)。其中，仅含GL-PS作为对照组；仅含多柔比星作为模型组 ；同时含有GL-PS和多柔比星的处理组为干预组。细胞培养48 h后，MTT法在波长550 nm处测定吸光度值表示细胞活力。细胞生长抑制率按照以下公式计算：细胞抑制率(%)=(对照组OD-模型或干预组OD)/对照组OD×100%。

3 结 果

3.1不同时间、不同浓度多柔比星对心肌细胞影响:实验结果表明不同多柔比星浓度对心肌细胞活性均有现抑制作用。但多柔比星以2μmoL/L的浓度作用24H抑制心肌细胞活性作用最强，当浓度增加到4μmoL/L时各时间点抑制率明显下降。以上结果表明选取多柔比星浓度为2μmoL/L，作用24h，为最佳实验浓度和时间。实验结果见表1。

3.2GL-PS对多柔比星所致H9C2心肌细胞抑制率的影响:在本研究中，模型组心肌细胞H9C2经过2moL/L多柔比星处理 24h后，细胞活力较对照组下降了40%左右。在加多柔比星之前1h给予不同质量浓度的GL-PS(3.125～25mg/L) ，显示一定的保护效果，随着GL-PS浓度升高细胞抑制率明显降低。见表2、图1。

表1 不同浓度多柔比星及不同作用时间对心肌细胞抑制率

表2 MTT测定GL-PS对多柔比星所致H9C2心肌细胞抑制率的影响

图1

图2

3.3显微镜观察GL-PS对多柔比星诱导心肌细胞形态的影响:如图可见，对照组正常心肌细胞呈现梭状，心肌细胞结构正常，细胞膜完整，细胞之间相互连接(见图2)；模型组大都数心肌细胞明显呈现圆缩形，细胞问连接减少，伪足消失，细胞肿胀，甚至出现死亡(见图3)；与模型组比较，GL-PS组心肌细胞结构功能和细胞形态显著改善，死亡细胞减少(见图4)。

图3

图4

注：心肌细胞形态变化(×100)

3.4对多柔比星抑制肿瘤细胞生长的影响:多柔比星在0.1moL/L浓度下，对MCF-7、KB及K562 3种细胞的抑制率分别为 42.0%，37.2%和 43.7%。提前1 h加入不同质量浓度 (3.125～25mg/L )的GL-PS，对上述细胞的抑制率分别为35.6%～42.1%，32.6%～43.6%，43.3～46.1%，此结果表明GL-PS对多柔比星抗肿瘤作用并无影响。

4 讨 论

多柔比星可抑制RNA和DNA合成，抗瘤谱较广，属周期非特异性药物，适用于急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、肉瘤等疾病，但目前认为总量不易超过450mg～550mg/m2，否则发生心脏毒性，严重时可出现心脏衰竭。普遍认为多柔比星心脏毒性与过量氧自由基的产生有关，抑制氧自由基的产生，或者直接清除过量氧自由基，均有助于减轻多柔比星的心脏毒性。Chen 等[2]卵巢癌大鼠模型上发现灵芝多糖肽能显著减少丙二醛的产生和增加血清抗氧化酶的活性，表明了灵芝多糖肽具有抗氧化、清除自由基作用。有研究表明，化疗病人的血清中多柔比星最高浓度为5μmoL/L[3]，本实验过程中，依据文献资料选取多柔比星浓度范围为1～6μmoL/L，经过不同的时间点6、12、24h作用。研究发现作用24h后，多柔比星对心肌细胞活性抑制率最高是2μmoL/L浓度。该时期多柔比星可造成心肌细胞大量死亡。然而，用3.125～25mg/L的GL-PS预处理细胞1h后，随着GL-PS浓度增加多柔比星诱导的死亡细胞的数量明显减少。说明GL-PS对心肌细胞具有直接保护作用。现代研究认为灵芝多糖肽不仅能够直接抑制肿瘤的生长和血管生成，还具有广泛的免疫调节作用[4]。但本实验将GL-PS与肿瘤细胞共培养未显示明显的协同增效作用。

目前，公认有效的抗多柔比星心脏毒性药物有辅酶Q10、右丙亚胺，但无口服有效的药物。在本研究中，未采用阳性对照药物，是本试验设计的不足之处 。但本研究提供的实验结果，仍能充分地证明GL-PS对于防治多柔比星心脏毒性的潜在价值。

[1] 曹容华．灵芝多糖对免疫调节作用的研究[J].山东医科大学学报，1993，31(4)：287～290．

[2] Chen YG, Shen ZJ, Chen X. Modulatory effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on serum antioxidant enzymes activities in ovarian cancer rats[J].Carbohydrate Polymers, 2009, 78(2): 258～262.

[3] Minotti G，Menna P，Salvatorelli E，Cairo G Gianni L．Anthracyclines：molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity[J].Pharmacol Rev,2004，56：185～229.

[4] Liang Z, Yi Y, Guo Y, et al. Chemical characterization and antitumor activities of polysaccharide extracted from Ganoderma lucidum[J].International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(5): 9103.

StudyontheProtectiveEffectofGanodermaLucidumPolysaccharidesaboutDoxorubicinInducingMyocardialCellInjury

XUFan,LIXiao,LIULanfang,etal

(TheAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,HebeiChengde067000,China)

Objective:To study the protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on adriamycin induced myocardial injury, and to explore the mechanism of adriamycin induced myocardial cell.MethodsDifferent concentrations of doxorubicin (1, 2, 4, 6μmol/L) with H9C2 were cultured for 6, 12, 24h，then calculated the cell inhibitory rates at different time and concentration;H9C2cardiac myocytes were cultured with Ganoderma lucidum polysaccharides of different mass concentrations (0, 3.125, 6.25, 12.5, 25mg/L),adding doxorubicin after 1h,observing morphological changes of the cells after 24h,calculating the cell inhibition rate；MCF-7，KB，K562 were cultured with Ganoderma lucidum polysaccharides,adding doxorubicin after 1h,after 48h calculating the cell inhibition rateResultsThe inhibition rate of 24h was the highest when 2μmol/L was cocultured with cells，25mg/L Ganoderma lucidum polysaccharides can significantly reduce the death of myocardial cells induced doxorubicin, and not reduce the anti-tumor effect of drugs.ConclusionGL-PS has a protective effect on myocardial cells, had no effect on adriamycin inhibit the growth of tumor cells, there is no synergistic effect.

Ganoderma lucidum polysaccharide; Myocardial cells; Adriamycin

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.10.002

1006-6233(2017)10-1588-04

李青山，E-maillibing200865@126.com

承德市科学技术研究与发展计划项目，(编号：201601A055)