TLR9、MyD88在颞叶癫痫大鼠海马组织中表达的动态变化

吴兴饶， 孔庆霞， 褚 旭

TLR9、MyD88在颞叶癫痫大鼠海马组织中表达的动态变化

吴兴饶1， 孔庆霞2， 褚 旭2

目的观察氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠各期海马中Toll-样受体9(TLR9)、髓样分化因子(MyD88)表达的变化，探讨其是否与颞叶癫痫发生有关。方法SD雄性大鼠120只，随机分为对照组(30只)和模型组(90只)，腹腔注射氯化锂。18 h～20 h后模型组腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态(SE)；对照组予等量生理盐水取代匹罗卡品腹腔注射。对照组和造模成功的模型组依据腹腔注射后时间随机分为10个亚组：急性模型组(SE后3 h、6 h、9 h、12 h、1 d、3 d、7 d)；潜伏模型组(SE后14 d、28 d)；慢自发发作组(SE后56 d)。每亚组动物模型组9只，对照组3只。免疫组化、蛋白印迹、RT-PCR 技术测定各亚组癫痫大鼠海马内TLR9、MyD88的表达。结果TLR9、MyD88在模型组海马内表达明显增多，与对照组相比，差异有显著性(P<0.05)。模型亚组内，TLR9、MyD88在急性期和慢性期表达明显增高，而潜伏期无明显表达变化。其中急性期内的增高多集中在癫痫发作后6 h；3组比较差异有显著性(P<0.05)。结论大鼠海马内TLR9、MyD88表达增多可能与颞叶癫痫发病有关，探讨其机制可能为颞叶癫痫的治疗提供新的靶点。

颞叶癫痫； TLR9； MyD88； 细胞因子

癫痫是神经内科的常见疾患之一，多数经药物治疗可缓解，但有约30%患者药物治疗无效，成为难治性癫痫。参与癫痫的发病机制十分复杂，迄今尚未完全阐明，近几年研究证实免疫炎症反应与癫痫的发生、发展密切相关，患者脑脊液(CSF)和血清中的促炎性细胞因子水平的增加提供了神经炎症在癫痫发生发展中参与的证据，而这些细胞因子多是由外源性和内源性配体的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)通过激活产生的。

TLRs是一类天然免疫的模式识别受体，属于跨膜蛋白，由富含亮氨酸重复序列组成的胞膜外区、跨膜区以及与1L-1受体胞内区保守序列有高度同源性的胞浆区组成，其能够识别微生物脂质、碳水化合物、蛋白质或核酸，而在先天性免疫系统中发挥关键作用。目前与癫痫有关的TLRs主要有TLR1、TLR3、TLR4、TLR9，其中TLR1、TLR3、TLR4报道的比较多。而TLR9、MyD88是否与难治性癫痫有关，其在难治性癫痫中的表达情况如何，国内外极少报道。本研究利用氯化锂-匹罗卡品点燃大鼠，制备难治性颞叶癫痫模型，结合免疫组化、免疫印迹、RT-PCR技术测定各期大鼠海马内TLR9、MyD88的表达。旨在探讨其与颞叶癫痫发生发展的相关性，为颞叶癫痫的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物健康雄性Sprague Dawley大鼠(山东鲁抗实验动物中心，生产许可证scxk鲁20140007)，倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)、恒冷切片机(德国Leica 公司)、荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)、转移电泳仪、垂直式电泳槽、电转移槽(北京市六一仪器厂)、氯化锂、匹罗卡品、甲基化阿托品(美国Sigma)，抗TLR9一抗(英国Abcam)，水合氯醛、普鲁士蓝试剂盒(北京索莱宝公司科技有限公司)，TLR9、MyD88引物(生工生物工程上海股份有限公司)，生理盐水(山东鲁抗医药股份有限公司)，无水乙醇、甲醇、氯化钠、多聚甲醛等实验室常用药品(山东省莱阳市铁塔化工用品厂)等。

1.2 实验动物颞叶癫痫模型制作及分组 选择健康雄性Sprague Dawley大鼠130只，随机分对照组(30只)和造模组(100只)，体重200～250 g，环境为清洁级，温度维持20 ℃，分笼饲养，饲以标准饲料，自由饮水，固定12 h人工昼夜循环的环境。采用氯化锂-皮罗卡品诱导急性颞叶癫痫模型，具体方法如下：所有SD大鼠第一天提前18～20 h腹腔注射氯化锂(LiCl)127 mg/kg；第2天提前30 min腹腔注射溴化甲基阿托品1 mg/kg，30 min后造模组腹腔注射新鲜配置的匹罗卡品30 mg/kg，并按照Racine癫痫行为标准观察记录大鼠行为30 min，若大鼠未达到Racine分级的Ⅳ～Ⅴ级的痫性发作，继续追加匹罗卡品的剂量，每隔10 min重复注射匹罗卡品一次，每次为10 mg/kg，最大追加剂量可达60 mg/kg。发作级别达Racine分级Ⅳ～Ⅴ级，发作持续1 h以上视为成功的颞叶癫痫模型。对照组则予等量生理盐水取代匹罗卡品腹腔注射。造模组内，在造模成功且存活的颞叶癫痫模型中，按照随机数字表法随机挑选出90只大鼠编为模型组进行实验，共分3个大组，10个亚组:急性模型组(SE后3 h、6 h、9 h、12 h、1 d、3 d、7 d)；潜伏模型组(SE后2 w、4 w)；慢自发发作组(SE后8 w)及相对应时间点对照组。每亚组动物模型组9只，对照组3只。

1.3 免疫组化分析检测TLR9蛋白在海马中的表达

1.3.1 脑组织取材 模型组及对照组大鼠均在造模后的相应时间点立即进行心脏灌注后取脑组织，首先麻醉、固定，依次以0.9%生理盐水、4%多聚甲醛经心脏灌注固定，分离脑组织置4%的多聚甲醛4 ℃ 过夜固定，后放入30%的蔗糖溶液中4 ℃浸泡至组织块沉底，后于海马吻合位置连续冠状冰冻切片，片厚4 μm，-80 ℃保存备用于免疫组化。每亚组取模型组3只大鼠，对照组1只大鼠。

1.3.2 免疫组化分析检测TLR9蛋白的表达 免疫组化步骤参照SABC-AP免疫组化染色试剂盒(博士德SA1052-兔Ig-G)说明书操作。冰冻切片于4 ℃下复温30 min，室温置于30% H2O2和纯甲醇混合液中(1∶50)30 min，以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次后，加入5%BSA封闭液，室温30 min。加入稀释的一抗(TLR9，1∶100;购于abcam公司) 4 ℃孵育过夜。取出后PBS清洗3次，每次5 min。滴加相应的二抗(生物素化山羊抗兔Ig-G)，室温30 min，PBS清洗3次，每次5 min。滴加SABC-AP，室温30 min，PBS洗5 min×3次。BCIP/NBT染色，镜下观察，控制显色时间。流水充分冲洗，苏木素染核，常规封片。实验重复3次。

1.4 Western blot检测TLR9蛋白在海马中的表达

1.4.1 海马总蛋白的提取 取造模后相应时间点的模型组及对照组大鼠，常规用10%水合氯醛(剂量300 mg/kg)麻醉后断头取脑，分离海马。液氮下研磨组织成粉末状，加入NP40组织裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，冰上裂解1 h，14000 r/min离心20 min，取上清，分装并冻存在液氮中备用。每亚组取模型组3只大鼠，对照组1只大鼠。

1.4.2 Western blot检测TLR9蛋白的表达 取出备用的各组海马总蛋白,以30 μg上样量，加入上样缓冲液后，标本煮沸5 min，然后迅速置于冰面冷却，上样，12%聚丙稀酰胺凝胶电泳分离(上层胶电泳电压70 V，1 h；下层胶电泳电压110 V，1 h)，转膜(转膜电压80 V，90 min)、封闭后，与一抗IL-1β/TLR9(1∶1000 浓度)4 ℃孵育过夜，与1∶2000浓度的HRP标记的相应二抗室温解育1 h后，ECL试剂发光，显影和定影。实验重复3次。

1.5 RT-PCR检测TLR9 mRNA、MyD88 mRNA在海马中的表达

1.5.1 海马总RNA的提取 取造模后相应时间点的模型组及对照组大鼠，常规用10%水合氯醛(剂量300 mg/kg)麻醉后断头取脑，分离海马。液氮下研磨组织成粉末状，按TRIzor法提取细胞RNA，紫外分光光度计测定其纯度和含量，OD260/OD280比值在1.8～2.0之间证明样本纯度好。每亚组取模型组3只大鼠，对照组1只大鼠。

1.5.2 RT-PCR检测TLR9 mRNA、MyD88 mRNA的表达 总RNA (1 μg)以Oligo dTPrimer为引物进行逆转录，操作按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(广州复能基因有限公司)说明进行。逆转录产物扩增采用2×Taq PCR Master Mix试剂盒(广州复能基因有限公司)，并参照其说明进行。TLR9、MyD88和β-Actin 引物(上海生工生物工程公司合成)扩增大小分别为243 bp、452 bp。TLR9：上游序列：5’-TGCCTTCCTACCCTGTGAAC-3’，下游序列：5’-AGGAAAGGCTGGTGATGTTG-3’；MyD88：上游序列：5’-GATCCCACTCGCAGTTTGTT-3’，下游序列：5’-GATGCGGTCCTTCAGTTCAT-3’；β-Actin：上游序列：5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游序列：5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’；反应条件：95 ℃预热10 min，94 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；循环25次。实验重复3次。

2 结 果

2.1 造模情况 SD大鼠腹腔注射匹罗卡品10 min后开始出现排便排尿躯体抖动行动刻板等，直至最终出现全身强直-阵挛癫痫大发作，待发作持续1 h以上后给予水合氯醛终止发作，并加强呼吸道护理，给予葡萄糖奶粉能量支持，降低死亡率。造模成功率为95%(100只大鼠，95只成功建立急性期模型，后死亡2只，存活93只)，从成功癫痫模型中随机选择90只癫痫大鼠用于模型组实验研究。

2.2 免疫组化结果 正常对照组大鼠海马组织中可见少量TLR9阳性细胞，而模型组内染色阳性细胞增多，呈棕黄色或红褐色，染色均一，多表达在细胞的胞浆，以点状或者串珠样分布，偶可见斑片状分布，表达明显部位常伴有细胞形态改变。与对照组相比，模型组海马内TLR9表达增多，差异有显著性。模型各亚组内TLR9蛋白急性期和慢性期表达增高显著，但潜伏期表达增多不明显；3组比较差异有显著性，且在急性期各组内明显见到差异，以3 h、6 h时期增高较为显著(见图1)。

2.3 Western-blot结果 与对照组相比，TLR9 蛋白在模型组海马内表达明显增多(P<0.05)。模型亚组内，急性期和慢性期TLR9蛋白表达增高显著，而潜伏期无明显表达变化；3组比较差异有显著性，且在急性期各组内明显见到3 h，6 h时期的显著增高(见图2)。

2.4 RT-PCR结果 对照组相比,TLR9 mRNA、MRP8 mRNA在模型组海马内表达增多。模型组内，TLR9 mRNA、MRP8 mRNA在急性期和慢性期表达显著增多(P<0.05)，潜伏期表达无明显改变； 在急性期各亚组内明显见到3 h，6 h时期的显著增高(P<0.05)(见图3)。

图1 各组大鼠海马内TLR9 表达变化(箭头所示)×200倍

图2 a、c：TLR9在各亚组海马中动态表达的变化； b、d：β-actin在各亚组海马中表达的变化

图3 a、b:TLR9 mRNA、MyD88 mRNA在各亚组海马中动态表达的变化

3 讨 论

癫痫是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病，其表现具有发作性、反复性、刻板性的特点。癫痫发作可导致神经元选择性损伤，甚至死亡，其对神经系统的损害并非随着放电的终止而停止，一次癫痫的急性发作就足以引起脑部边缘叶特定区域神经元的脱失[1,2]。在氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫动物模型中，痫性发作包括急性边缘性发作，其进一步可发展为癫痫持续状态(epileptic state,SE)，即进入急性期，急性期后伴随一个潜伏期及稍后出现的自发性再发作阶段，最后出现以自发性反复癫痫发作为特征的慢性癫痫阶段。癫痫持续状态可引起海马神经元的神经病理改变，导致相关神经元的坏死、变性或凋亡，神经元内DNA进而释放出来。TLR9作为族中唯一识别DNA的受体，经典配体是非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸序列DNA(CpG-DNA)，其活化的信号传导属于典型的髓样MyD88依赖性信号转导途径。国外研究发现TLR9有起到维持大脑结构完整性的神经保护作用。Taito Matsuda等人[3]通过动物实验发现成年大鼠海马小胶质细胞的TLR9能够识别变性神经元的自身DNA活化，分泌TNF-α(肿瘤坏死因子-α)，通过调节神经干细胞/祖细胞的增生来削弱由痫性发作引起的异常神经再生。也有报道指出癫痫患者海马神经元损伤的DNA能够刺激小神经胶质TLR9，由此引发的TNF-α产生通过NF-κB信号传导途径，影响海马齿状回神经祖细胞的减少[4,5]，而对TLR9敲除的癫痫小鼠的研究中，其癫痫发作的频率和时间都要比野生型癫痫小鼠更为严重。Tauber SC等人[6]通过Morris水迷宫测试发现，通过连续注射的CpGDNA，刺激TLR9，能够导致小鼠的认知功能障碍，从一定程度上暗示TLR9与癫痫有一定联系，但具体作用尚未明确。我们推测癫痫发作引起神经元坏死等释放的DNA可作为TLR9配体，进而激活TLR9，又通过细胞内一系列衔接分子如MyD88等的相关作用，激活NF-κB等一系列信号途径，引起相关炎症介质的表达，导致炎症反应的发生。

在本实验中，TLR9在颞叶癫痫大鼠海马内表达增多，暗示TLR9在癫痫中具有潜在研究价值。其中急性期及慢性期表达增高较潜伏期显著，潜伏期无明显表达变化，提示TLR9的表达变化与模型组大鼠癫痫发作呈相关性。我们推测，癫痫发作所致神经元等脑内神经细胞的损伤，释放的DNA可能是TLR9被激活的原因。在癫痫发作初期，血脑屏障未完全破坏打开，TLR9增高并不显著。Michalak[7]等在海人酸急性癫痫模型中的研究也证实癫痫持续状态后血脑屏障通透性会增加并于SE后4 h～24 h血脑屏障通透性最大，急性期内TLR9的增高多集中在癫痫发作后6 h左右或与此有关。随着病情进展，脑屏障逐渐破坏打开，大量星形胶质细胞增生及胶质化，这也可能是慢性期TLR9增高的一个原因，我们观察到大约7 d左右，TLR9还会有一个上升趋势，可能是由于癫痫大鼠处于自发性发作阶段。实验结果还显示，MyD88在难治性颞叶癫痫大鼠海马内表达在一致性，间接表明TLR9活化的信号传导属于典型的髓样MyD88依赖性信号转导途径，而二者相互作用关系如何？MyD88能否单独在癫痫中发挥一定作用？目前国内外少有报道。

TLR9在中枢神经系统(CNS)的神经元和胶质细胞中都有表达，且主要存在于具有吞噬作用的小胶质细胞中。目前，大量的研究已经证实由TLR9信号通路参与的炎症反应起到了神经损伤作用。 Derkow等[8]研究发现，TLR9特有配体通过激活小胶质细胞后分泌一些可溶性因子，包括IL-1β和IL-23，从而引起依赖MyD88途径的γ、δT细胞的激活，使IL-17分泌，进而引起了对神经元的毒性作用，这种毒性作用需要神经元与γ、δT细胞之间的直接联系。Rosenberger等人[9]在研究单个和两两激活小胶质细胞内的TLRs对神经炎症反应和退行性变的影响时，还发现TLR2、TLR4、TLR9的两两激活比各个单个激活引起了更严重的炎症反应。如前所述，国外最新研究也指出，TLR9有起到维持大脑结构完整性的神经保护作用，暗示其在神经保护方面的作用。由此可见TLR9在癫痫病理过程中的作用机制复杂，正性及负性的调控均存在于病理过程之中。 我们推测，癫痫发作后，激活的小胶质细胞可以分泌促炎因子或抗炎因子，执行其神经损伤和神经保护双向作用，TLRs则是小胶质细胞执行双向作用的一类很关键的受体蛋白。TLR9在不同的中枢神经系统疾病中所起到的作用是不同的，在癫痫疾病中，类似的相关研究比较少，或者TLR9本身分泌了多种因子，既有IL-1β、IL-17等促炎因子，也有TNF-α等抗炎因子，或者其神经保护作用被同时激活的TLR4等作用较强信号通路的神经损伤作用所掩盖，目前尚不能明确，这也是我们下一步将要探讨的问题。

[1]Bengzon J,Mohape lP,Ekdahl CT,et al.Neuronal apoptosis after brief and prolonged seizures[J].Prog Brain Res,2002,135:111-119.

[2]Henshall DC,Chen J,Simon RP.Involvement of caspase-3-like proteasein the mechanism of cell death following focally evoked limbic seizures[J].JNeurochem,2000,74(3):1215-1223.

[3]Taito Matsuda.TLR9 signalling in microglia attenuates seizure-induced aberrant neurogenesis in the adult hippocampus[J].Nat Commun,2015,9(5):6:6514.

[4]Parent JM,Yu TW,Leibowitz RT,et al.Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus[J].Neurosci,1997,17:3727-3738.

[5]Cho KO,Lybrand ZR,Ito N,Brulet R,et al.Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline[J].Nat Commun,2015,6:6606.

[6]Tauber SC,Ebert S,Weishaupt JH,et al.Stimulation of Toll-like receptor 9 by chronic intraventricular unmethylated cytosine-guanine DNA infusion causes neuroinflammation and impaired spatial memory[J].Neuropathol Exp Neurol,2009,68:1116-1124.

[7]Zuzanna Michalak,Takanori Sano,Tobias Engel,et al.Spatio-temporally restricted blood-brain barrier disruption after intra-amygdala kainic acid-induced status epilepticus in mice[J].Epilepsy Res,2013,103(2-3):167-79.

[8]Katja Derkow,Christina Krager,Paul Dembny,et al.Microglia induce neurotoxic IL-17+γδT cells dependent on TLR2,TLR4,and TLR9[J].PLoS One,2015,10(8):e0135898.

[9]Karen Rosenberger,Katja Derkow,Paul Dembny,et al.The impact of single and pairwise Toll-like receptor activation on neuroinflammation and neurodegeneration[J].Journal of Neuroinflammation,2014,11:166.

DynamicexpressionchangesofTLR9andMyD88inhippocampusoftemporallobeepilepsyrats

WUXingrao,KONGQingxia,CHUXu.

(GraduateSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

ObjectiveTo investig ate the dynamic expression changes of TLR9 and MyD88 in hippocampus of the epilepsy rats induced by from lithium chloride-pilocarpine during the development of epilepsy，and to explore whether they induced the pathogenisis of the temporal lobe epilepsy.Methods120 male healthy Sprague-Dawley rats were divided randomly into control group and LiCl-Pilocarpine experimental group.The experimental rats were intraperitoneally injected with LiCl (127 mg/kg) and Pilocarpine (30 mg/kg) to induce status epilepticus(SE).SE was stopped with 10% chloral hydrate intraperitoneally injecting 60 minutes later.The rats in the control group and the experimental group were randomly divided into 10 subgroups:acute group (3 h,6 h,9 h,12 h,1 d,3 d,7 d),latent group (2 w,4 w),chronic group (8 w).Survival rats were continuously observed for onset and recurrence of spontaneous seizures every day and were grouped and sacrificed at corresponding time after the last pilocarpine injection respectively.The control rats were mitted tales doses of 0.9% saline and grouped and sacrificed at the same time after the saline injection.And all groups were executed by using immunohistochemistry，Western-blotting and RT-PCR analysis to examine the dynamic expression of TLR9 and MyD88 in the subfields of each gourps hippocampus.ResultsCompared with control group，the expression of TLR9 and MyD88 increased in all of the model group (P<0.05).In all of model group,the expression of TLR9 and MyD88 increased more significantly in acute stage and chronic stage than the latent stage(P<0.05).Acute phase increase more concentrated in 6 h.ConclusionThe evelated expressions of TLR9 and MyD88 in epilepsy rat hippocampus indicate they could be responsible for the epileptogensis of temporal lobe epilepsy.The TLR9/MyD88 pathway may play an important role in the pathogenisis of temporal lobe epilepsy.

Temporal lobe epilepsy; TLR9; MyD88; Cytokines

R742.1

A

1003-2754(2017)10-0888-05

2017-06-15；

2017-09-28

国家自然科学基金面上项目(No.81371423);济宁市科技发展计划项目[济科字(2015) 57号-94]

(1.天津医科大学研究生院，天津 300070;2.济宁医学院附属医院神经内科，山东 济宁 272000)

孔庆霞，E-mail:kqx1970@aliyun.com