自身免疫调节因子在重症肌无力患者胸腺内的表达及作用分析

闫 斌， 朱明振， 李卫君， 贾丽景

自身免疫调节因子在重症肌无力患者胸腺内的表达及作用分析

闫 斌1， 朱明振1， 李卫君1， 贾丽景2

目的比较自身免疫调节因子(AIRE)在重症肌无力(MG)患者及正常人胸腺内的含量，分析AIRE在MG发病中的作用。方法收集濮阳市人民医院胸外科MG胸腺切除患者的胸腺组织及心脏外科手术患者的胸腺组织，将其分为MG合并胸腺异常组(A)、MG胸腺正常组(B)、对照组(C)。采用蛋白免疫印迹法及荧光定量PCR法比较3组胸腺内AIRE基因及蛋白含量。结果C组(0.75±0.04)AIRE基因含量明显高于A(0.42±0.08)、B(0.45±0.08)两组，差异有统计学意义(P<0.05);A、B两组之间AIRE基因含量差异无统计学意义(P>0.05)。C组(0.72±0.05)AIRE蛋白含量较A(0.40±0.08)、B(0.50±0.05)两组高，差异有统计学意义(P<0.05);A、B两组之间蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论MG患者胸腺内AIRE基因及蛋白含量较对照组偏低，而与胸腺病理类型无关，AIRE在MG发病过程中有重要作用。

自身免疫调节因子； 重症肌无力

重症肌无力(MG)是由多种抗体介导的发生在神经肌肉接头处的自身免疫性疾病[1]，有研究表明，MG的发生与胸腺关系密切，约75%的MG患者胸腺发生异常，其中约85%为胸腺增生，约15%为胸腺瘤[2]，自身免疫调节因子(AIRE)与大多数胸腺异常有关，研究认为AIRE蛋白参与了胸腺T细胞的发育及分化过程[3]，已经证实MG的发病主要与T淋巴细胞的异常活化有关，而AIRE在胸腺内T淋巴细胞删除自身抗原过程中有重要作用，参与自身抗原耐受的调节，AIRE与胸腺细胞的发育关系密切[4]，但AIRE因子在MG患者胸腺内的表达情况及其在MG发病过程中的作用仍少有报道。

1 材料与方法

1.1 材料 反转录试剂盒(TaKa Ra公司)，鼠抗人AIRE抗体(美国Sana cruz公司)，兔抗人β-actin抗体(北京博奥森公司)，HRP标记的羊抗鼠抗体(武汉博士德公司)，HRP标记的羊抗兔抗体(北京中杉金桥公司)，AIRE引物序列由上海生工有限公司合成。

1.1.1 一般资料 选取2013年1月-2017年1月在濮阳市人民医院胸外科住院行胸腺切除术治疗的MG患者37例，均符合重症肌无力诊断标准[5]。其它原因的肢体无力疾病及就诊前3 m应用过免疫抑制剂者除外，其中男性15例，女性22例，年龄3～45岁，平均年龄(23.5±2.5)岁，胸腺异常者20例，胸腺正常17例。眼肌型27例，全身型10例；选择同期在心脏外科行开胸手术的15例心脏手术患者的部分胸腺标本为对照组，男9例，女6例，年龄4～40岁，平均年龄(18.5±3.5)岁，排除重症肌无力及其他自身免疫疾病、且在3 m内未使用过免疫抑制类及激素类药物，对照组胸腺病理切片为正常胸腺组织。两组在年龄、性别构成差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者均签署知情同意书，并由濮阳市人民医院伦理委员会批准，所有胸腺标本取出后立即存放于液氮中。

1.2 研究方法

1.2.1 实验分组 A组为MG患者的异常胸腺标本;B组为MG患者的正常胸腺标本;C组为对照组即正常人的正常胸腺标本。

1.2.2 荧光定量PCR法检测3组AIRE mRNA含量 在Gene Bank中获得人AIRE序列，Premier 5.0设计引物，上游引物序列5’-CAACGGGTCCTGCCCAACAG-3’，下游引物序列5’-CGCATACATGGCCTATAACAT-3’；β-actin作为内参，其上游引物序列为5’-GGCCCGGACACGTCATTCT-3’，下游引物序列为5’-CCGGGCACGCAGCACCAT-’，分别取上述3组胸腺组织30 mg，用Trizol一步法分别提取3组RNA，按反转录试剂盒说明书将RNA反转成cDNA，荧光定量PCR法采用20 μl反应体系,荧光变性反应条件为95 ℃30 s；PCR反应条件：95 ℃ 5 s、55 ℃ 2 min、72 ℃ 30 s，40个循环；取10 μlPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确保引物设计的特异性。将内参基因Ct值与目的基因的Ct值之比作为标准化的目的基因相对定量，即β-actin的拷贝数/目的基因拷贝数。

1.2.3 蛋白免疫印迹法检测3组AIRE蛋白含量 分别取上述3组胸腺组织标本各30 mg，液氮中快速研磨得到匀浆，加入裂解液，室温避光40 min，6000 rpm离心5 min后取上清，BCA法测3组蛋白浓度，每孔加20 μl样品，β-actin作为内参，稀释比例1∶1500鼠抗人AIRE抗体及1∶2000兔抗人β-actin抗体冰箱内4 ℃孵育过夜，37 ℃复温40 min，稀释比例1∶5000 HRP标记的羊抗鼠抗体和1∶5000 HRP标记的羊抗兔抗体，在37 ℃水浴箱孵育1 h，曝光成胶片，采用图像分析软件Quantity One分别测定3组AIRE和β-actin的显色条带平均值，各组蛋白表达强度为二者平均值的比值。

2 结 果

2.1 荧光定量PCR法 结果显示C组AIRE mRNA含量明显高于A、B组，差异有统计学意义;A、B两组之间含量差异无统计学意义(见表1、图1)。

2.2 蛋白免疫印迹法 结果显示C组AIRE蛋白含量较A、B组高，差异有统计学意义;A、B两组之间含量差异无统计学意义(见表1、图2)。

表1 AIRE基因及蛋白含量表达比较

*P<0.05,**P<0.05

图1 3组胸腺内AIRE mRNA表达电泳图

图2 蛋白免疫印迹法比较3组胸腺内AIRE蛋白表达

3 讨 论

AIRE蛋白是一种具有转录活化潜能的结合蛋白[6]，定位于细胞核中，分布在细胞核附近，与基因转录调控有关，主要表达在胸腺髓质上皮细胞中(mTEC)，T细胞在胸腺发育过程中应经历阴性选择，以删除自身反应性细胞，通过此途径而对自身抗原的中枢耐受，目前研究显示[7]，AIRE蛋白对暴露这些自身抗原起着重要作用，AIRE蛋白表达于mTEC细胞后，诱导mTEC细胞表达组织相容性复合体(MHC)/人类白细胞抗原(HLA)，从而参与T细胞的选择过程。研究已表明[8]95%的胸腺瘤与AIRE基因缺失有关，但AIRE基因与MG之间的关系研究较少。

MG是一种常见的发生在神经肌肉接头处的自身免疫性疾病，而约85%MG患者血清中可发现乙酰胆碱受体抗体(AChR-ab)，还有多种其它类型的自身抗体如MuSK-ab、LRP4-ab[9]，这些自身抗体的产生是由于自身抗原中枢性耐受受损，MG患者胸腺内T细胞发育异常，胸腺微环境是T细胞的发育的主要结构，在胸腺内阴性选择过程中，AIRE起到重要作用，它控制调解性T细胞表达，促进组织特异性抗原胸腺细胞内的表达，参与自身免疫耐受形成，在敲除AIRE基因的小鼠中，可观察到多种自身免疫疾病的发生。

MG和胸腺关系密切，MG患者多数伴有胸腺异常，本研究结果显示，C组AIRE mRNA含量及蛋白含量均明显高于A、B组，差异均有统计学意义(P<0.05)；A、B两组之间含量差异均无统计学意义(P>0.05)。即MG患者胸腺瘤组、MG胸腺正常组中的AIRE的基因含量及蛋白含量较对照组减少，差异有统计学意义；组间比较胸腺异常组、胸腺正常组治疗差异无统计学意义。MG患者胸腺内AIRE的含量较正常人降低，而与MG患者胸腺的病理类型无关，提示我们AIRE与MG的发病有关，MG是一种自身免疫性疾病，与胸腺内T细胞选择过程中自身抗原的删除有关，MG患者胸腺内AIRE表达减少时，神经肌肉接头处的自身抗原无法删除，从而诱导了针对神经肌肉接头处的自身抗体，有研究表明AIRE参与胸腺内调节性T细胞(Treg)发育[10]，说明 AIRE在重症肌无力发病过程的起始阶段，即胸腺内的自身抗原细胞删除过程中有重要作用，为以后进一步研究AIRE的作用提供一定的依据。

[1]Wolf Z,Vernau K,Safra N,et al.Association of early onset myasthenia gravis in Newfoundland dogs with the canine major histocompatibility complex class[J].Neuromuscul Disord,2017,27(5):409-416.

[2]Richards J,Howard JF.Seronegative myasthenia gravis associated with malignant thymoma[J].Neuromuscul Disord,2017,27(5):417-418．

[3]Guha M,Saare M,Maslovskaja J,et al.DNA breaks and chromatin structural changes enhance the transcription of Autoimmune Regulator target genes[J].J Biol Chem,2017,292(16):6542-6554.

[4]Torres-Vega E,Mancheo N,Cebrian-Silla A,et al.Netrin-1 receptor antibodies in thymoma-associated neuromyotonia with myasthenia gravis[J].Neurology,2017,3(1):206-208.

[5]Cui Xin Zheng,Ji Xin-Ying,Gao Feng,et al.Evaluation of the new classification and surgical strategy for myasthenia gravis[J].American Surgeon,2012,78(12):1329-1335.

[6]Zhang X,Ding XJ,Wang Q,et al.Rs3761389 polymorphism in autoimmune regulator (AIRE) gene is associated with susceptibility of myasthenia gravis in Chinese patients[J].Clin Neurosci,2017,40(6):180-184.

[7] Melo-lima BL，Evangelista AF,Magalhaes DA,et al.Differential transcript profiles of MHC class 1b and aire genes during the ontogeny of thymus and other tissues[J].J Immunol Res,2014,2014:159247.

[8] Strobel P,Chuang WY,Chuvpilo S,et al.Common cellular and diveres genetic basis of thymoma-associated myasthenia gravis:role of MHC class II and AIRE genes and genetic polymorphisms[J].Ann N Y Acad Sci,2008,1132:143-156.

[9]Zisimopoulou P,Brenner T,Trakas N,et al.Serological diagnostics in myasthenia gravis based on novel assays and recently identified antigens[J].Autoimmunity Reviews,2013,12(9):924-930.

[10]Liu B,Gao W,Zhang L,et al.Th17/Treg imbalance and increased interleukin-21 are associated with liver injury in patients with chronic severe hepatitis B[J].Int Immunopharmacol,2017,1(3):48-55.

Theexpressionandfunctionoftheautoimmuneregulator(AIRE)inthymuswithmyastheniagravispatients

YANBin,ZHUMingzhen,LIWeijun,etal.

(DepartmentofNeurology,PuyangPeople’sHospital,Puyang457000,China)

ObjectiveTo compare the content of autoimmune regulator (AIRE) in thymus with myasthenia gravis (MG) patients and the normal,then we analyze role of AIRE on the pathogenesis of MG.MethodsThe patients those have cardiac surgery with MG thymus tissue are collected in puyang city people’s hospital.These patients are divided into three groups,MG patients with thymoma group (A),MG patients with normal thymus group (B),the control group (C).Western blots method and fluorescence quantitative PCR method are used to compare thymus AIRE gene and protein content in the three groups.ResultsThe content of AIRE gene in C group(0.75±0.04) is obviously higher than that of A(0.42±0.08),B(0.45±0.08)groups,the difference is statistically significant(P<0.05).The content of AIRE gene in the A,B groups has no statistical significance (P>0.05).The content of AIRE protein in C(0.72±0.05)group is obviously higher than that of A(0.40±0.08),B(0.50±0.05)groups,the difference is statistically significant(P<0.05).The content of AIRE protein in the A,B groups has no statistical significance(P>0.05).ConclusionThe content of AIRE gene and the protein in MG patients with thymus is lower than the control group,and has nothing to do with thymus pathological type.The AIRE plays an important role on the pathogenesis of MG.

Autoimmune regulator; Myasthenia gravis

R746.1

A

1003-2754(2017)10-0913-03

2017-06-03；

2017-09-28

( 1.河南省濮阳市人民医院神经内科，河南 濮阳 457000；2.河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050000)

贾丽景，E-mail:jij997@126.com