α7神经型尼古丁受体激动剂PNU282987对APP/PS1小鼠海马组织中AP180蛋白表达的影响

邓于新， 王晓玲， 吴昌学， 官志忠,3， 齐晓岚

α7神经型尼古丁受体激动剂PNU282987对APP/PS1小鼠海马组织中AP180蛋白表达的影响

邓于新1,2， 王晓玲1,2， 吴昌学1,2， 官志忠1,2,3， 齐晓岚1,2

目的探讨特异性激动APP/PS1转基因小鼠中的α7nAChR后其海马组织中突触后膜蛋白的表达变化。方法选择16只经过鉴定的APP/PS1小鼠随机分为APP/PS1组(APP/PS1)和APP/PS1+PNU282987组(AP)，每组各8只；另选16只野生型小鼠随机分为对照组(Control)和野生+PNU282987组(WP)，每组各8只。饲养小鼠达到24周龄后，AP组和WP组于每天进行Morris水迷宫行为学测试前4 h腹腔注射PNU282987 (1 mg/kg/d)，之后利用Morris水迷宫进行行为学测试，Real-time PCR及Western blotting法分别检测各组小鼠海马组织中AP180 mRNA及蛋白水平的表达情况。结果与对照组比较，APP/PS1组海马组织中AP180 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.01，P<0.01)；而特异性激动α7 nAChR水平后，WP组中AP180 mRNA和蛋白水平升高(P<0.01，P<0.05)；与APP/PS1组相比AP组小鼠大脑海马组织中AP180 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.01,P<0.01)。结论特异性激动APP/PS1转基因小鼠海马组织中α7 nAChR能够使网格蛋白介导的突触囊泡内吞过程中的关键蛋白AP180表达水平升高。这可能提示了α7nAChR对突触有一定的保护作用，进一步说明α7nAChR在阿尔茨海默病的发病中起着重要作用。

α7神经型尼古丁受体； 阿尔茨海默病； APP/PS1转基因鼠； AP180

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知功能障碍和记忆损伤为主要临床特征的致死性神经退行性疾病，最早定义为大脑神经元和突触的损伤[1]。AD的核心病理因素β淀粉样蛋白(Aβ)的聚集直接或间接的导致了突触结构和功能的破坏[2]，也有研究表明，突触数量的减少与认知能力的减退有密切的联系[3]，从一定程度上表明突触的结构损坏和功能障碍在AD认知功能下降与年龄相关的神经元结构和功能改变中扮演了重要角色[4]。α7胆碱能尼古丁受体(α7nAchR)在AD的发病中具有神经保护性作用而成为AD研究中的重要对象[5]，而AP180是网格蛋白介导的突触囊泡内吞过程中的关键蛋白之一。本研究旨在以衔接蛋白180(AP180)为例,探讨α7nAchR水平对小鼠海马组织中突触相关蛋白表达的影响，为AD的防治新思路提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性阿尔茨海默病APPswe/PSldE9双转基因模型小鼠(B6.Cg-Tg)及同背景雌性野生型小鼠，体重20～30 g，均购自上海南方模式生物公司[动物许可证号：SCXK(沪)2014-0002]。繁殖采用1只雄鼠与3只雌鼠同居的方式进行。成功繁殖后，当新生的小鼠年龄达到2～3 w时剪鼠尾提取小鼠DNA，进行小鼠基因型鉴定。第19～20天后子鼠雌雄分笼饲养。实验动物遵照国家实验动物饲养和使用指南，采用独立通风柜饲养，动物房常年温度控制在(24±2)℃，湿度40%～60%，光照时间8：00～21：30。所有动物均饲养于贵州医科大学实验动物中心SPF级环境。所有实验操作均获得贵州医科大学实验动物伦理委员会的许可。

1.2 试剂 Morris水迷宫、Morris水迷宫监测软件购于中国医学科学院药物研究所；TANON 4200全自动化学发光成像分析系统购于上海天能科技有限公司；兔抗鼠α7 nAchR多克隆抗体(sc-5544)、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗均购于美国SANTA CRUZ公司；兔抗鼠AP180多克隆抗体(ab33898)购于英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购于美国cell signaling公司；PNU282987购于Sigma公司；BCA蛋白定量分析试剂盒购于美国Thermo公司；RIPA高效裂解液购于北京索莱宝公司；ECL发光试剂、PVDF膜均购于美国Millipoe公司；RNA逆转录试剂盒购于Thermo公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司；β-actin、AP180定量PCR的引物均由上海生物工程有限公司设计并合成。

1.3 动物饲养繁殖及分组 APP/PS1双转基因雄鼠同相同背景的野生型雌鼠杂交进行繁殖，对新生小鼠剪尾提取DNA鉴定，APP/PS1转基因小鼠饲养至24 w，野生型小鼠相同条件下饲养至24 w。将16只经过鉴定的APP/PS1小鼠随机分为APP/PS1组和APP/PS1+PNU282987组(AP组)，每组各8只；另将16只野生型小鼠随机分为空白对照组(Control组)和PNU282987组(WP组)，每组各8只。

1.4 方法

1.4.1 Morris水迷宫行为学检测 小鼠饲养至24周龄后，各组进行Morris水迷宫测试，测试持续5 d，其中APP组和WP组于每天测试前腹腔注射α7 nAchR激动剂PNU282987，剂量为1 mg/kg。记录Morris测试过程中小鼠的逃避潜伏期及穿越平台次数。实验内容包括：(1)定位航行实验：共进行4 d，每只小鼠每天完成4次训练，每次从不同象限将小鼠面向池壁放入水中，观察并记录其穿越平台的时间、次数以及停留平台的时间。如在60 s内未能寻找到平台，则将其引导至平台并停留10 s。(2)空间探索实验：第5天测试，撤除平台。记录小鼠在60 s内各象限寻找平台的次数和逗留平台象限时间，找到平台次数越多和逗留平台象限时间长，说明空间记忆能力好(见图1)。

1.4.2 组织处理及蛋白提取 各组小鼠在行为学测试结束后，腹腔注射4%水合氯醛(0.2 ml/10 g)进行麻醉， 开胸经左心室快速灌注预冷0.1 mol/L PBS 40 ml后，快速除去颅盖，小心取出脑组织在冰上分离得到海马组织，于-80 ℃保存备用。

1.4.3 Real-time PCR检测AP180 mRNA表达水平 运用Trizol一步法提取细胞总RNA后将mRNA逆转录成为cDNA备用，应用ABI Step One Plus型实时荧光定量PCR仪以逆转录得到的cDNA作为模板进行Real-time PCR，所用引物由生工合成(引物序列见表1)。运用SDS 2.1软件收集和分析AP180、β-actin基因扩增各循环产生的荧光信号，并计算上述基因在各实验组与对照组比较的相对表达水平(RQ=2-ΔΔCt)。重复3次独立实验，各样本每次3个复孔。

1.4.4 Western 印迹法检测海马组织蛋白中AP180蛋白水平 收集小鼠海马组织，加入裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，12000 r、4 ℃离心20 min，收集上层清液即为蛋白质。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，Western印迹法检测各组中AP180蛋白表达水平，以各组蛋白条带像素灰度值与内参蛋白β-actin的比值表示各组蛋白的相对表达水平。重复3次独立检测，每次3个复孔。

2 结 果

2.1 24周龄APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力测试 24周龄各组小鼠通过Morris水迷宫测试，在第5天的定位航行试验中，以各组小鼠在目标象限持续时间(s)、平均逃避潜伏期(s)及跨越平台次数(N)为认知能力指标进行比较，结果显示，24周龄APP/PS1双转基因小鼠在目标象限持续时间缩短、逃避潜伏期明显延长、穿越平台次数少，与野生型小鼠比较均有统计学意义(P<0.01),表明24周龄APP/PS1双转基因小鼠确实存在学习记忆能力方面的损害；而且AP组与APP/PS1组比较，平台所在象限持续时间延长,逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多，差异均具有统计学意义(P<0.01)，提示注射PNU282987激动α7 nAchR具有保护APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的作用；另外，WP组与野生型小鼠比较，平台所在象限持续时间延长,逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多，差异具有统计学意义(P<0.01)，也在一定程度上提示了激动α7 nAchR具有保护小鼠学习记忆能力的作用。

2.2 各组中AP180 mRNA及蛋白表达水平 Real-time PCR检测AP180 mRNA表达水平，结果显示：与对照组比较，WP组AP180 mRNA表达水平增高，APP/PS1组AP180 mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；AP组与APP/PS1组比较，AP180 mRNA表达水平增高，差异具有统计学意义(P<0.01)。运用Western blot检测各组小鼠海马AP180蛋白表达情况，结果显示：与对照组相比较，WP组AP180蛋白表达水平均增高(P<0.05)，APP/PS1组AP180蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；AP组与APP/PS1比较，AP180蛋白表达水平增高，差异具有统计学意义(P<0.01)(见图2)

表1 荧光定量PCR引物序列及产物片段

与对照组相比差异有统计学意义*P<0.05；与对照组相比差异有高度统计学意义**P<0.01；与APP/PS1组之间比较差异具有高度统计学意义##P<0.01

图1 各组小鼠Morris水迷宫学习记忆能力测试结果

与对照组相比差异有统计学意义*P<0.05；与对照组相比差异有高度统计学意义**P<0.01；与APP/PS1模型组相比差异有高度统计学意义##P<0.01

图2 各组小鼠海马组织中AP180 mRNA(A)及蛋白表达水平(B)

3 讨 论

阿尔茨海默病(AD)是一种越来越常见的神经退行性病变，多发于老年人，在65岁以上的人群中，AD的发病率已经达到约5%～10%[6]。AD的主要临床特征为进行性的认知功能损害和记忆能力下降。在AD患者大脑存在几个典型的病理特征：细胞外的淀粉样斑块沉积、细胞内的神经纤维缠结以及基底前脑胆碱能神经元变性和突触丢失，其中突触丢失与认知功能下降有更好的相关性[7]。APP/PS1双转基因小鼠可表达突变的人类早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉样前蛋白(APPswe)融合体。APP/PS1双转基因小鼠APP和Psl基因的突变可以导致Aβ水平的升高，模拟AD的神经病理过程[8]。胆碱能系统功能降低在AD早期阶段已有表现，在AD的发生发展中有一定作用[9]。胆碱能系统中的神经型尼古丁受体(Neuronal nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)在大脑的学习、认知及记忆功能方面有一定的调节作用，并参与许多信号传递的调控，具有显著的神经保护作用；nAChR是第二信使非依赖性、门控性离子通道偶联受体，可与神经递质结合，本身也是离子通道，其开放不需要第二信使的参与。nAChR由α和β两种亚基组成，不同种类的亚基以不同的组合形式组成不同的五聚体结构，主要调节细胞内外Na+、K+和Ca2+等离子的流动，其表达量的改变与Aβ呈负相关，在AD的发展中起关键的调控作用[10,11]。

α7nAChR 是神经型尼古丁受体中重要的成员[12]，有报道指出在AD中最脆弱的神经元是那些高表达神经型尼古丁受体的神经元，特别是含有α7 nAChR亚单位的[13],且在 AD患者胆碱能系统损伤与α7nAChR水平下降和突触损伤有关[14]，其在调节神经可塑性方面具有独特的作用，在神经保护中起了重要的作用。因此，α7nAChR成为近年来研究的热点。课题组前期的研究也表明Aβ 能明显降低大鼠及培养细胞中α7nAChR的表达，而α7nAChR基因表达沉默能通过影响细胞APP代谢相关酶的表达而增加Aβ的生成[15]，二者互为因果。激活的α7nAChR可以调节神经元兴奋性和神经递质释放、改变突触可塑性，对维持记忆及认知功能的十分重要[16]。PNU是α7nAChR激动剂中特异性较高的合成物，与其他nAchR亚单位结合微乎其微，与α7nAChR结合，提高和改善AD动物模型的认知和记忆功能[17]。

突触是大脑中信息存储和传递的基本结构和功能单位。突触囊泡再循环是脑内的神经递质进行释放和循环再利用的一个关键过程，它有两种再循环形式：其一即通过形成短暂存在的融合孔使神经递质从突触囊泡释放；其二为通过网格蛋白介导使突触囊泡与突出前膜融合以胞吐的形式释放神经递质，然后仍然通过网格蛋白介导将神经递质以胞吞的形式重新吸收形成新的突触囊泡，完成突触囊泡再循环。目前尚没有证据表明前一种循环形式对突触功能有明显影响，当前的研究主要以网格蛋白介导的胞吐和胞吞形式为主要模式[7]。AP180是一种神经特异性的蛋白，是网格蛋白包被的主要成分之一，它参与了网格蛋白包被过程，同时也调节着新形成的突触囊泡的大小。

尽管AD的主要病理学改变是Aβ沉积形成的老年斑和神经元纤维缠结，但近年的研究结果表明突触丢失是认知功能低下的主要危险因素之一。突触丢失致使突触联系障碍，神经元与神经元之间信息传递中断，学习、记忆和认知能力下降。研究显示[18,19]，AD患者和动物模型的脑组织中存在一定程度的突触关联中断、网格蛋白介导的突触囊泡内吞功能降低以及神经细胞突触回收囊泡的能力下降。通过对AD患者尸体解剖研究证实，AD脑组织突触功能低下。但引起AD脑中突触丢失及功能低下的具体机制目前还不十分清楚。本实验主要研究特异性激动APP/PS1转基因小鼠脑组织中α7nAChR水平后对海马组织网格蛋白AP180蛋白的影响，从而探讨α7nAChR在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD) 发病机制中的神经保护作用机制。本研究选用24周龄的APP/PS1双转基因模型小鼠，行为学Morris水迷宫实验结果表明：APP/PSl双转基因组小鼠和非转基因组小鼠都具有一定的空间记忆能力，但24周龄APP/PSl双转基因小鼠空间探索实验结果与同月龄小鼠有差异,说明24周龄APP/PSl双转基因小鼠学习记忆能力出现下降，这和APP/PSl双转基因小鼠行为学特点一致。实验结果显示APP/PS1双转基因模型小鼠海马组织中AP180蛋白表达水平下降，表明在AD早期即已出现突触蛋白表达含量下降。此外，本实验结果还显示，特异性激动α7nAChR水平后，与对照组相比WP组小鼠大脑海马组织中AP180蛋白表达水平升高；与APP/PS1组相比AP组小鼠大脑海马组织中AP180蛋白表达水平明显升高。因此，我们推测可能原因是α7nAChR对突触有一定的神经保护作用，α7nAChR与突触密切相关。因而，进一步研究α7nAChR对突触活动的调控有重要的研究意义，为AD的早期诊治提供一定的帮助。

[1]余 抒,府伟灵.阿尔茨海默病及诊断学研究进展[J].临床检验杂志,2016,34(1):49-51.

[2]Upadhaya AR,Capetillo-Zarate E,Kosterin I,et al.Dispersible amyloid β-protein oligomers, protofibrils,and fibrils represent diffusible but not soluble aggregates their role in neurodegeneration in amyloid precursor protein (APP) transgenic mice[J].Neurobiol Aging,2012,33(11):2641-2660.

[3]沈 阳,陈 宇,傅洁瑜,等.老年痴呆症的分子机制[J].生命科学,2014,6:550-559.

[4]董阳婷,谭龙春,官志忠.β-淀粉样肽对大鼠原代海马神经细胞中SIRTs表达的影响[J].贵阳医学院学报,2016,41(12):1376-1381.

[5]Parri H,Hernandez CM,Dineley KT,et al.Research update:Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor mechanisms in Alzheimer’s disease[J].Biochem Pharmacol,2011,82(8):931.

[6]景 鑫,田 新,黄金兰,等.氧化应激在阿尔茨海默病中的作用及相关药物研究[J].生物技术世界,2015,10:157-159.

[7]夏志明,胡雅儿.突触囊泡再循环与阿尔茨海默病[J].生理科学进展,2012,43(1):5-10.

[8]Selkor DJ.Alzheimer’s disease: genes,Proteins,and therapy [J].Physiol Rev,2001,81:741-766.

[9]Medeiros R,Castello NA,Cheng D,et al.α7 nicotinic receptor agonist enhances cognition in aged 3xTg-AD mice with robust plaques and tangles[J].Am J Pathol,2014,184:520-529.

[10]Taly A,Corringer PJ,Guedin D,et al.Nicotinic receptors: allosteric transitions and therapeutic targets in the nervous system[J].Nat Rev Drug Discov,2009,8(9):733-750.

[11]Cao Y,Xiao Y,Ravid R,et al.Changed clathrin regulatory proteins in the brains of Alzheimer’s disease patients and animal models[J].J Alzheimer’s Dis,2010,22(1):329-342.

[12]Tanzi RE.The synaptic abeta hypothesis of Alzheimer’s disease[J].Nat Neurosci,2005,8(8):977-979.

[13]Cao Y,Xiao Y,Ravid R,et al.Changed clathrin regulatory proteins in the brains of Alzheimer’s disease patients and animal models[J].J Alzheimer’s Dis,2010,22(1):329-342.

[14]曹 颖,廖 媛,肖 雁,等.β淀粉样肽对人SH-SY5Y细胞突触素、发动蛋白及衔接蛋白180表达的影响[J].中华神经医学杂志,2011,10(8):774-778.

[15]Haass C,Selkoe DJ.Soluble p rotein oligomers in neur odegeneration:less ons from the Alzheimer’s amyloid β2pep tide[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(2):101-112.

[16]Nordman JC,PhilipsWS,Kodama N,et al.Axon targeting of the alpha 7 nicotinic receptor in developing hippocampal neurons by Gprinl regulates growth[J].J Neurochemist,2014,129(4):649-662.

[17]Vicens P,Heredia L,Torrente M,et al.Behavioural effects of PNU-282987 and stress in an animal model of Alzheimer’s disease[J].Psychogeriatrics,2017,17(1):33-42.

[18]Yao PJ,Zhu M,Pyun EI,et al.Defects in expression of genes related to synaptic vesicle trafficking in frontal cortex of Alzheimer’s disease[J].Neurobiol Dis,2003,12(2):97-109.

[19]Pham E,Crews L,Ubhi K,et al.Progressive accumulation of amyloid-beta oligomers in Alzheimer’s disease and in amyloid precursor protein transgenic mice is accompanied by selective alterations in synaptic scaffold proteins[J].Federation of European Biochemical Societies,2010,277(14):3051-3067.

Theeffectsexpressionofα7neuronalnicotinereceptoragonistPNU282987onAP180proteininhippocampusofAPP/PS1Mice

DENGYuxin,WANGXiaoling,WUChangxue,etal.

[KeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology(GuizhouMedicalUniversity),Guiyang550004,China]

ObjectiveTo investigate the expression of AP180 protein in hippocampus of specific agonized APP/PS1 transgenic mice after specific activation of α7nAChR.Methods16 APP/PS1 mice were randomly divided into APP/PS1 group (APP/PS1) and APP/PS1+PNU282987 group (AP),8 mice in each group;16 wild-type mice were randomly divided into wild group (Control) and wild+PNU282987 group (WP),each group of 8.Mice were reached after 24 weeks of age,Morris water maze behavioral test,Real-time PCR and Western blotting were used to detect AP180 mRNA expression and protein level in the hippocampus of mice in each group.ResultsCompared with the control group,AP180 mRNA and protein expression in the hippocampus of APP/PS1 group were significantly decreased (P<0.01,P<0.01).Compared with the control group,the expression of AP180 mRNA and WP1 in the WP group was significantly higher than that in the control group (P<0.01,P<0.05).Compared with APP/PS1 group,AP180 mRNA and protein levels in hippocampus of AP group were significantly increased (P<0.01,P<0.01).ConclusionThe specific activation of α7 nAChR in hippocampus of APP/PS1 transgenic mice could increase the expression level of key protein AP180 in the endocytosis of synovial vesicles mediated by cathepsin.This may suggest that α7nAChR has a protective effect on synapses,further indicating that α7nAChR plays an important role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease.

α7 nAChR; AD; APP/PS1 transgenic mouse; AP180

R749.1

A

1003-2754(2017)10-0872-04

2017-08-17；

2017-10-03

国家自然科学基金(81360178)；贵州省重大专项计划[黔科合重大专项字(2014)6008号]；贵州省创新计划项目[黔教合协同创新中心(2014)06]；贵州省科技创新人才团队[黔科通(2016)161号]

[1.地方病与少数民族疾病教育部重点实验室(贵州医科大学)，贵州 贵阳 550004；2.贵州省医学分子生物学重点实验室(贵州医科大学)，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学病理学教研室，贵州 贵阳 550004]

齐晓岚，E-mail：xiaolan76@163.com