水果酵素对小鼠酒精性肝损伤保护作用的研究

冯 莉，张鹤鑫，何国库，徐怀德，雷宏杰*

（1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.东莞市赫群生物科技有限公司，广东 东莞 523000）

水果酵素对小鼠酒精性肝损伤保护作用的研究

冯 莉1，张鹤鑫1，何国库2，徐怀德1，雷宏杰1*

（1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.东莞市赫群生物科技有限公司，广东 东莞 523000）

该试验研究了小鼠酒精性肝损伤模型的建立以及水果酵素对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。结果表明，连续白酒灌胃可引起小鼠肝脏损伤，表现为肝脏指数和血清指数升高、肝脏过氧化物含量升高、肝脏抗氧化能力降低以及肝细胞肿胀和脂肪变性等。与模型组相比，不同浓度的水果酵素均可有效恢复肝脏指数、降低血清中谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（ALT）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、丙二醛（MDA）水平，提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）水平。病理学观察结果显示肝脏脂肪变性得到改善，肝脏细胞排列较为整齐，组织结构趋于正常，说明水果酵素可预防和修复酒精对小鼠肝脏的损伤，具有一定的保肝效果。

水果酵素；抗氧化；脂肪代谢；保护作用

饮酒过量是长期困扰全球的重要公共卫生问题，也是导致肝脏疾病爆发的主要原因。我国酒文化历史悠久，是酒品的消费大国，随着我国居民生活水平的提高，饮食结构发生了巨大的变化，尤其是酒精的摄入量逐年增长，相应的酒精性肝损伤的发病率也日益攀升。酒精性肝损伤的发病机制非常复杂，呈现多层次、多途径、多方面的损伤[1-5]，涉及到酒精代谢产物引起的损伤、炎症反应、氧化应激及脂质过氧化等，发病早期如脂肪肝和肝炎尚可逆转，一旦恶化至肝硬化，肝脏损伤不仅不可逆转，而且除肝移植外尚缺乏有效的治疗措施[6-9]。因此，酒精性肝损伤的防治是医学上的一个重要难题。

酵素是以一种或多种蔬菜、水果、食用菌、中草药等为原料，经多种益生菌发酵而成的，富含生物酶、矿物质、维生素以及次生代谢产物等的功能性生物发酵产品，酵素可加速人体内生化反应进程，但不会改变生化反应的方向和最终产物的理化性质[10-11]。酵素是维持生命活动正常进行的一种必需的物质，但是生物体内的酵素水平会随着年龄的增长而减少，从而引发机体的快速衰老，增加患病的风险，适当补充酵素可保持机体的基本功能和良好状态[12]。目前，初步研究证实植物酵素具有平衡机体、消炎抗菌、美白抗衰老、改善胃肠道、解酒护肝等多种保健功能[13-17]。

本研究以水果酵素为研究对象，该水果酵素是由多种水果（包括黑醋栗、苹果、红醋霉、杨桃、蔓越莓、莱姆、凤梨、柳丁、香蕉、黑莓、奇异果、木瓜、葡萄柚、百香果、草莓、香吉士、柑橘、柚子、柿子、覆盆莓、李子、梅子、梨、酪梨、番茄、枣、柠檬、蓝莓）经复合菌种（酵母菌、双歧杆菌、乳杆菌）发酵而成，其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性为665.80 U/mL。旨在探讨水果酵素对小鼠酒精性肝损伤的保护作用，为进一步研究和开发水果酵素的保健功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级雄性昆明小鼠144只，体质量（30±2）g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。饲养条件：温度（22±2）℃，相对湿度（55±5）%，照明时间12 h/d。

水果酵素：某公司生产；水飞蓟素：德国马博士大药厂；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；红星二锅头：北京红星股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HC-3018R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；E100生物显微镜：尼康有限公司；UV-1780紫外可见分光度仪：日本岛津仪器有限公司；7180型全自动生化分析仪：日本日立高新技术公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小鼠酒精性肝损伤模型的建立与分组

试验小鼠适应性喂养7 d后，将小鼠随机分为6组：正常组、模型组、水飞蓟素阳性对照组（50mg/kg）、水果酵素低剂量组（原液稀释4倍，10 mL/kg）、中剂量组（原液稀释2倍，10 mL/kg）、高剂量组（原液，10 mL/kg）。每组24只。各阳性对照组和样品组每天灌胃一次，正常组和模型组每天灌胃等量的生理盐水，持续14d。小鼠每周称体质量2次，根据体质量的变化及时调整灌胃量。模型组、阳性对照组和样品组于第15天开始，灌胃体积分数为30%乙醇。正常组灌胃等量生理盐水。各模型组、阳性对照组和样品组在灌胃间隔4 h以上再灌胃乙醇，持续28 d。具体方案见表1。

表1 实验动物分组及灌胃方式Table 1 Grouping of experimental animals and intragastric administration method

1.3.2 样品的采集与处理

于最后一次灌胃后，各组试验小鼠禁食不禁水16 h，然后对各组小鼠进行称质量，眼球取血，收集血液，4℃、4 000 r/min离心15 min，血清于4℃保存。颈椎脱臼处死小鼠后解剖取肝脏，用预冷的生理盐水（4℃）清洗，滤纸拭干，称质量，取肝左叶组织用4%多聚甲醛进行固定，制作石蜡切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，于光学显微镜下检查组织病理学变化；取剩余部分肝组织，用预冷生理盐水（4℃）制备10%肝脏组织匀浆。

1.3.3 检测指标及方法

（1）小鼠肝脏指数

（2）肝脏病理学检查

于400倍光学显微镜下观察肝细胞的形态变化、炎症反应、纤维化、脂肪空泡等病理变化。

（3）生化指标检测

采用全自动生化分析仪测定血清中谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）活性等肝功能指标与血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量等肝脏脂肪代谢指标；按照试剂盒说明书测定肝匀浆丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）活性等肝脏抗氧化能力指标。

1.3.4 数据分析方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计和差异显著性分析，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 小鼠肝脏指数及肝功能的变化

在整个试验过程中，正常组小鼠的饮食和排泄表现正常，无死亡现象。但在乙醇灌胃期间，模型组、水飞蓟素阳性对照组、水果酵素组均表现出不同程度的反常现象。尤其是模型组的小鼠行动迟缓、毛发凌乱、光泽度差，而阳性对照组和水果酵素组小鼠的状态与模型组相比，均有不同程度的改善。由表2可知，与正常组相比，模型组小鼠的肝脏指数升高了35%，其原因是长期的酒精灌胃使小鼠的肝脏发生了肝肿胀现象。而与模型组相比，阳性对照组和水果酵素组的小鼠肝脏指数均有所降低（降低了21%～24%），其中水果酵素高剂量组的肝脏指数下降效果更显著，接近正常组的肝脏指数水平。

ALT和GOT是存在于肝脏细胞质和线粒体中两种重要的转氨酶，正常情况下其在血清中的含量很低，当肝细胞受损或坏死时，ALT和GOT就会渗入血液中。因此，血清中ALT和GOT水平的高低是反应肝脏细胞受损程度的特异性指标，也是临床上常用的肝功能评价指标[18-19]。由表2可知，与正常组相比，模型组小鼠的ALT和GOT活性显著升高，分别升高了108%和38%，说明小鼠酒精性肝损伤模型的建立成功。与模型组相比，阳性对照组和水果酵素高剂量组小鼠血清中的ALT和GOT活性均显著降低，尤其是水果酵素高剂量组小鼠，其血清中的ALT和GOT已接近正常组水平，仅分别比正常组高5%和4%。表明水果酵素在一定程度上能够改善肝细胞膜的通透性，抑制肝细胞受损、坏死。

表2 水果酵素对小鼠血清ALT和GOT活性及肝脏指数的影响Table 2 Effect of fermented fruit beverage on the ALT,GOT activity and liver index in mice

2.2 小鼠肝脏脂肪代谢的变化

肝脏是酒精和脂肪的代谢场所，酒精的过度摄入会造成肝脏脂肪代谢功能降低，导致脂类物质在肝脏内堆积，进而造成肝脏的脂肪性病变，直接导致血液中TG、TC含量上升。由于HDL-C和LDL-C与体内胆固醇的运输有关，因此其含量会随着血液中TG、TC含量的变化而波动[20-21]。

表3 水果酵素对小鼠肝脏脂肪代谢的影响Table 3 Effect of fermented fruit beverage on the fat metabolism of liver in mice mmol/L

由表3可知，与正常组相比，模型组小鼠血清中的TG、TC含量显著升高，分别升高了142%和63%。但水飞蓟素或水果酵素均可降低小鼠血清中的TG、TC含量，水飞蓟素和水果酵素高剂量组的效果尤为明显，且效果相当，与模型组相比，水飞蓟素和水果酵素高剂量组可降低TG和TC含量分别约56%和26%。与正常组相比，模型组小鼠血清中LDL-C含量显著上升，升高了150%，而HDL-C含量显著下降，下降了30%。与模型组相比，水飞蓟素和水果酵素均可不同程度上恢复小鼠血清中的LDL-C和HDL-C水平，而且水飞蓟素和水果酵素高剂量组的效果较好，可降低LDL-C含量约32%，升高HDL-C含量至少38%以上。结果表明，水果酵素能够促进肝脏内脂肪的转化，加速脂蛋白在机体内运输胆固醇的速度，最终起到调节脂肪代谢的作用。

2.3 小鼠肝脏抗氧化能力的变化

乙醇在线粒体中的氧化过程中，其代谢产物乙醛能够诱导细胞色素活性增强，产生大量的自由基，不饱和脂肪酸和膜胆固醇易于同自由基作用发生过氧化反应[22-24]。脂质过氧化物中以MDA较为重要，其含量的高低代表肝细胞受损时出现的氧化作用的强弱，组织中MDA含量越高，氧化活性越强，组织受损程度就越大，同时还会大量消耗机体的SOD和GSH，这两种酶对维持机体的氧化损伤平衡起到至关重要的作用，是清除机体自由基的主要酶类[25-26]。如表4所示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏中的过氧化物MDA含量明显升高，升高了100%。而给予水飞蓟素及不同浓度的水果酵素均可显著降低肝脏组织中的MDA水平，尤其是高浓度的水果酵素效果最佳，与模型组相比，可降低MDA约61%，与正常组一致。模型组小鼠肝脏组织中的SOD、GSH-PX活性与正常组相比，均呈现显著下降趋势，分别下降了49%和60%。与模型组相比，水飞蓟素和水果酵素处理均可显著提高SOD、GSH-PX活性，最大分别约40%和70%，但仍低于正常组水平。

表4 水果酵素对小鼠肝脏抗氧化能力的影响Table 4 Effects of fermented fruit beverage on the antioxidant capacity of liver in mice

2.4 小鼠肝脏组织病理的变化

HE染色结果如图1所示，正常组小鼠的肝小叶结构清晰、完整，肝细胞排列整齐、大小正常，胞浆均匀，无炎症细胞浸润，无明显的肝组织变性、水肿、坏死等现象。模型组小鼠肝组织病理损伤严重，肝组织出现水肿、坏死及炎症细胞浸润，肝小叶结构紊乱，肝索排列不规则，表现出轻度的纤维化和毛细血管扩张等。与模型组相比，水果酵素低剂量组小鼠的肝细胞气球样变及细胞水肿症状有所改善，但肝小叶结构仍然混乱。中剂量、高剂量水果酵素组的小鼠肝脏脂肪变性得到改善，肝脏排列较为整齐，组织结构趋于正常。

图1 水果酵素对小鼠肝脏组织病理损伤的影响Fig.1 Effect of fermented fruit beverage on the pathological injury of liver in mice

3 结论

持续乙醇灌胃可引起小鼠肝脏损伤，表现为血清指数含量升高、肝脏过氧化物含量升高、肝脏抗氧化能力降低、以及肝细胞肿胀和脂肪变性，反映了酒精性肝损伤的生化和病理特征。而水果酵素可有效恢复肝脏指数、降低血清中GOT、ALT、TG、TC、LDL-C、MDA水平，提高HDL-C、SOD、GSH-PX水平，肝脏脂肪变性得到改善，肝脏细胞排列较为整齐，组织结构趋于正常。因此，水果酵素可有效预防和修复酒精对小鼠肝脏的损伤。

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Protective effects of fermented fruit beverage on alcoholic liver injury in mice

FENG Li1,ZHANG Hexin1,HE Guoku2,XU Huaide1,LEI Hongjie1*
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Dongguan Herzgroup Biological Technology Co.,Ltd.,Dongguan 523000,China)

The establishment of model of alcoholic liver injury in mice and the protective effect of fermented fruit beverage on alcoholic liver injury in mice were researched.Results showed that feedingBaijiu(Chinese liquor)could cause mice liver injury by increasing liver index,serum index and liver peroxide content,decreasing liver antioxidant capacity,hepatocellular swellinge and fatty degeneration.Compared to the model group,different concentrations of fermented fruit beverage could effectivelyrestore liver index,decrease glutamic oxalacetic transaminase(GOT),alanine transaminase(ALT),triglyceride(TG),total cholesterol(TC),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C)and malondialdehyde(MDA)in serum,and increase high density lipoprotein cholesterol(HDL-C),superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px).Results of pathological observation showed liver fatdegeneration wasimproved,the liver cellswere aligned,the organizationalstructure tendsto be normal,which fermented fruit beverage could prevent and repair alcoholic liver injury in mice,and had certain protective effect on liver.

fermented fruit beverage;antioxidation;fat metabolism;protective effect

TS255.4

0254-5071（2017）09-0112-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.024

2017-05-03

校企合作横向课题（K403021513）

冯 莉（1988-），女，博士研究生，研究方向为果蔬加工。

*通讯作者：雷宏杰（1984-），男，讲师，博士，研究方向为食品生物技术、食品发酵与酿造。