新疆阿勒泰地区酸奶疙瘩中乳酸菌的分离和鉴定

刘俊峰，尹 雪，郭雪峰*

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团 塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

新疆阿勒泰地区酸奶疙瘩中乳酸菌的分离和鉴定

刘俊峰1，2，尹 雪1，郭雪峰1，2*

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团 塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

从新疆阿勒泰地区牧民制作的传统酸奶疙瘩中分离、筛选出菌株SA，通过过氧化氢酶试验阴性初步确定其为乳酸菌，对菌株SA进行菌落和细胞形态、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析及系统进化树分析。结果表明，分离菌株SA与Weissella cibaria KACC 11862 AEKT01000037聚为一类，其同源性为99%，故将其鉴定为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。其最佳生长条件为40℃、pH 6.0，并且能够耐受3%的NaCl。

乳酸菌；分离；鉴定

我国新疆地区水草丰盛，少数民族牧民们采用传统古老的方法制作乳制品，生产的方法流程简单，风味很独特，含有大量对机体有益的乳酸菌。研究发现新疆哈萨克牧民对酸奶的食用可能是预防食道癌的有效方法之一[1]。本试验中从新疆阿勒泰地区牧民家庭制作的酸奶疙瘩中分离筛选优势乳酸菌株，为优势乳酸菌功能的开发利用奠定一定的基础，同时也为保护我国丰富的乳酸菌资源，丰富的发酵剂种类提供依据。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在很多领域中有较高的应用价值，它们可以用于工业乳酸的生产、发酵乳制品、发酵蔬菜、酸面包、青贮材料、微生物饲料添加剂和乳酸菌医用制剂等。乳酸菌的分类至少分为23个属300多个种[2]，而乳酸菌一般包括肉食杆菌属、明串珠菌属、酒球菌属、片球菌属、链球菌属、乳杆菌属、漫游球菌属、乳球菌属、四联球菌属和魏斯氏菌属等[3]。对乳酸菌的基础鉴定主要基于表型和生化特征，按照细胞形态来分，可将乳酸菌分为杆菌和球菌，根据葡萄糖代谢途径的不同，可以将乳酸菌的发酵类型分为同型发酵和异型发酵[4]。最初区分乳酸菌不同菌属的方法都是基于表型特征和生物化学鉴定。然而随着不断涌现的新种属的描述，利用这些经典方法可靠地鉴定到种属变得越来越困难。随着科技的进步分子生物学方法能够将菌种鉴定到种甚至是亚种，许多新的分子标记技术已经广泛运用到乳酸菌的分类鉴定[5-7]。彭斌[8]从新疆传统奶疙瘩中的乳酸菌进行了分丽筛选，得到了可用于发酵乳制品生产的组合菌株，优化奶疙瘩发酵工艺，改善传统奶疙瘩的质量品质。凌空等[9]从新疆传统发酵骆驼奶、马奶子和辣椒酱中分离筛选得到13株乳酸菌，筛选获得了3株具有潜在生产应用价值的乳酸菌。敖晓玲[10]以川西高原牧区自然发酵的酸乳中分离出109株乳酸菌（杆菌59株、球菌50株）作为研究对象，通过初筛、复筛及组合发酵实验，确定了生产酸奶的最佳菌种、菌种组合和发酵条件。

本实验是从阿勒泰地区牧民制作的传统酸奶疙瘩中分离、筛选出优良的乳酸菌菌株，进行生理生化试验，结合16SrRNA序列比对方法进行菌种鉴定，然后经过人工培养和筛选得到能够稳定存在的菌种，投放到工业化生产中，使其对传统手工制作的特色酸奶疙瘩工业化生产奠定一定的基础，使得发酵乳食品对人体产生更高的营养价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸奶疙瘩：新疆阿勒泰地区农户家购买的传统手工制作。购买的酸奶疙瘩装在事先灭菌好的采样瓶中，低温保存快速带到实验室保存于冰箱中。

蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；溴甲酚紫（分析纯）：北京京土恒盛商贸有限公司；硫酸锰（分析纯）：天津市光复精迅化工研究所。

MRS固体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉4 g/L，吐温-80 1.0 mL，KH2PO42.0 g/L，柠檬酸二胺2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，琼脂粉15 g/L，蒸馏水100 mL，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，pH值为6.2，121 ℃条件下高压灭菌15 min备用。用于乳酸菌的分离筛选及纯化。

PY培养基：蛋白胨5 g/L，酵母浸粉10 g/L，胰蛋白胨5g/L，盐溶液40mL/L，葡萄糖30g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。盐溶液成分：氯化钙0.2 g/L，七水硫酸镁0.48 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，碳酸氢钠10.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，氯化钠2.0 g/L。pH值为7.2，121℃条件下高压灭菌15 min备用。用于乳酸菌产酸产气的基础培养基。

1.2 仪器与设备

DHP-9162B电热恒温培养箱、SW-CJ无菌操作台：上海精宏实验设备有限公司；TDL-60B离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；T6新世纪紫外可见光光度计：北京君意东方电泳设备有限公司；M313437恒温摇床：金坛市高科仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化

用90mL蒸馏水将10g酸奶疙瘩样品进行溶解，然后在摇床中振荡2 h，取酸奶样品梯度稀释，在7个试管中各加入9 mL蒸馏水，取样品1 mL加入第一个试管，然后摇匀后取1 mL至第二个试管，然后依次取1 mL直至所有的梯度稀释完，取10-5、10-6、10-7、10-8这四个稀释度的悬液100 μL涂布于MRS琼脂培养基上四个对应区域，用涂布棒推匀，在37℃，用烛缸法培养48h，连续进行分离纯化3次后挑取单个菌落，接种于MRS培养液中，置于37℃培养24 h。观察记录培养基中单菌落的形态，革兰氏染色后的细胞形态特征，并进行过氧化氢酶反应试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶触反应试验阴性的杆菌或球菌，初步定为疑似乳酸菌的菌株，并进一步纯化、培养和保藏。

1.3.2 菌种的菌落形态鉴定

在洁净的载玻片上滴加一滴蒸馏水，用灭菌好并冷却后的接种环挑取单菌落涂均匀涂抹于载玻片上，然后干燥固定。初染时加草酸胺结晶紫一滴，约1 min后水洗；媒染时滴加碘液冲去玻片上残留的蒸馏水，并覆盖约1 min，同样用蒸馏水水洗；脱色时将载玻片上面的蒸馏水甩尽，用用体积分数为95%酒精滴加冲洗至流出酒精刚好不出现紫色为止，脱色时间约为20～30 s，然后用蒸馏水冲洗把玻片上的酒精冲洗干净；复染时用番红液染30 s，然后用蒸馏水冲洗；等到切片干燥后加盖玻片封片，并做好标记。滴加松柏油一滴，然后置于油镜下观察。

挑取单菌落于洁净的载玻片上，然后滴加一滴3%过氧化氢，观察有无气泡产生，不产生气泡为阴性，可初步判断为疑似乳酸菌的菌株。

1.3.3 菌种生理生化鉴定[11-13]

温度生长试验：将培养24 h后的乳酸菌悬液以5%的量接种于pH 6.5的MRS液体培养基中，分别放置于5℃，10℃、40℃、45℃中静置培养。5℃、10℃培养14 d，40℃、45℃培养7 d，观察生长情况。每24 h取一次样，于波长600 nm条件下测定吸光度度值，每次测3组平行样并计算平均值。

产酸与产气试验：在PY培养基的基础上加入40 g/L葡萄糖酸钠，0.5 mL/L吐温80，6 g琼脂，14 mL/L溴甲酚紫做成软琼脂，置于112℃灭菌20～30 min备用。将活力强的乳酸菌菌液接种滴加在软琼脂柱内混匀，在表面加盖一层约7 mm厚的2%琼脂，30℃培养24～36 h，即可观察乳酸菌产酸和产气的情况。

耐酸与耐盐试验：接种前每个pH取6 mL MRS培养基做空白对照。分别将菌液接种在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的MRS液体培养基中培养7 d观察菌株生长情况。在NaCl含量为3.0%和6.5%的MRS液体培养基中接种菌株培养7 d观察菌株的耐盐能力。每24 h取一次样，于波长600 nm条件下测定吸光度值，每次测3组平行样并计算平均值。

碳源发酵试验：使用细菌微量生化反应管来观察乳酸菌的碳源发酵情况，在使用时用磨砂轮将管的一段折断，然后用用灭菌并冷却好的接种针进行纯菌种的接种，用封口膜将管口进行密封，然后整齐的置于小烧杯中放在35℃的恒温培养箱中进行培养，18～24 h后观察记录结果即可。

1.3.4 菌种16S rDNA鉴定[14-15]

采用16SrDNA序列分析方法对菌种进行鉴定，釆用细菌基因组DNA抽提试剂进行提取，然后按照Axygen公司说明书进行操作。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）体系及程序：在95℃下进行预变性3 min，94℃下进行变性1 min，60℃退火30 s，最后在72℃下延伸2 min，从变性到延伸需要30个循环，其中上游引物为FA-27F（5'-GCA GAGTTCTCG GAG TCA CGA AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3'），下游引物为RA-1495R（5'-AGCGGATCACTT CAC ACA GGA CTA CGG GTA CCT TGT TAC GA-3'）。

PCR产物电泳检测：PCR产物与等量的染色液混合，取其5μL，用1%琼脂糖凝胶作为载体进行电泳，电压为100V，电泳时间1 h，检测是否有特异性条带，并将PCR产物送到武汉华大基因测序。用MEGA5.0软件对基因序列进行分析，然后构建系统发育树，对菌株进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离及形态观察[14]

对酸奶疙瘩样品中微生物进行分离，得到1株乳酸菌，将其命名为SA。菌株SA的菌落及细胞形态特征见图1。由图1A可知，分离纯化后菌株SA的菌落呈乳白色、有光泽、表面光滑，不透明、圆形隆起、边缘整齐。由图1B可知，进行革兰氏染色、镜检观察菌株SA菌落呈紫色、短杆状、两端钝圆、无芽孢、成对或呈短链状、染色呈革兰氏阳性。

图1 菌株SA的菌落形态(A)及细胞形态(B)Fig.1 Colonial morphology(A)and cell morphology(B)of stain SA

2.2 生理生化鉴定

对分离得到的乳酸菌SA进行生理生化特性分析，具体结果见表1。

表1 菌株SA的生理生化特性分析结果Table 1 Analysis results of physiological and biochemical characteristics of strain SA

由表1可知，该株菌种产气产酸，属于异型发酵。在5℃条件下菌株的生长缓慢，在40℃时菌株的生长速度最快，能够耐受3%的NaCl，在pH6.0条件下生长旺盛。菌株SA的碳源发酵试验结果显示该乳酸菌菌种不能发酵山梨糖、卫茅糖、赤鲜糖、鼠李糖、淀粉、半乳糖和葡萄糖酸盐，而能够利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖等大多数的糖类。

2.3 16S rDNA鉴定结果

以乳酸菌株SA基因组DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图2可知，待测菌条带明亮清晰，且无明显拖尾，均在1500bp附近，与预期扩增大小一致，说明扩增成功，可以进行下一步16S rDNA基因序列的测定。

图2 菌株SA 16S rDNA PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification product of strain SA

2.4 构建系统发育树

图3 菌株SA的16S rDNA基因序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain SA based on 16S rDNA gene sequence

由图3可知，基因序列测定后，将乳酸菌菌株的16SrDNA基因测序结果在数据库中利用BLAST软件进行分析，可以得出分离菌株SA与Weissella cibariaKACC 11862 AEKT01000037聚为一类，其同源性为99%，故将菌株SA鉴定为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。

3 结论

通过纯培养的方式对酸奶疙瘩样品中的微生物进行分离，得到1株生长状况良好的乳酸菌株命名为SA。菌株SA的菌落呈乳白色、有光泽、表面光滑，不透明、圆形隆起、边缘整齐。镜检观察菌株SA菌落呈紫色、短杆状、两端钝圆、无芽孢、成对或呈短链状，革兰氏染色结果呈阳性。将菌株SA经过生理生化鉴定、16S rDNA基因测序结果在GenBank数据库中利用BLAST进行分析，可以得出该株菌株为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。该菌株最适生长条件为温度40℃、pH 6.0、并且能够耐受3%的NaCl。

[1]魏 艳，曾小群，潘道东，等.新疆地区不同酸奶中优势乳酸菌的分离与鉴定[J].中国食品学报，2012，12（12）：161-166.

[2]凌代文.乳酸菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999：156-158.

[3]SALMINER S,WRIGHT A.Lactic Acid Bacteria Microbiology and Functional Aspects 2th edition[M].New York:Marcel Dekker Inc,1998:253-257.

[4]张 刚.乳酸细菌-基础、技术和应用[M].化学工业出版社，2007：12-14.

[5]BELGACEM Z B,DOUSSET,X,PRÉVOST,et al.Polyphasic taxonomic studies of lactic acid bacteria associated with Tunisian fermented meat based on the heterogeneity of the 16S-23S rRNA gene intergenic spacer region[J].Arch Microbiol,2009,191(17):711-720.

[6]CHAO S-H,TOMII,SASAMOTO,et al.Lactobacillus capillatussp.nov.,a motile bacterium isolated from stinky tofu brine[J].Int J Syst Evol Mictobial,2008,58(10):2555-2559.

[7]STEPHENSON D P,MOORE,et al.Comparison and utilization of repetitive-element PCR techniques for typingLactobacillusisolated from the chicken gastrointestinal tract[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(11):6764-6776.

[8]彭 斌.新疆传统奶疙瘩中乳酸菌的分离筛选及奶疙瘩生产工艺优化研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2010.

[9]凌 空，翟 磊，姚 粟，等.新疆传统发酵食品中乳酸菌的分离鉴定及其生长代谢特性[J].食品与发酵工业，2017，43（3）：123-129.

[10]敖晓玲.川西高原牧区自然发酵酸乳中优良酸乳发酵剂菌株的筛选[D].雅安：四川农业大学，2005.

[11]凌代文，东秀珠.乳酸细菌分离鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999：43-47.

[12]菜信之，黄君红.微生物学实验[M].北京：化学工业出版社，2010：76-77.

[13]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：370-373.

[14]李 远，巴吐尔，张小燕，等.新疆哈萨克族传统发酵驼乳中乳酸菌的分离鉴定[J].中国食物与营养，2011，25（1）：54-58.

[15]尚天翠，刘 影.伊犁地区乳品中乳酸菌的分离及鉴定[J].食品研究与开发，2012，33（5）：168-171.

Isolation and identification of lactic acid bacteria in yogurt pimple from Aletai prefecture of Xinjiang

LIU Junfeng1,2,YIN Xue1,GUO Xuefeng1,2*
(1.College of Animal Science,Tarim University,Alar 843300,China;2.Key Laboratory of Tarim Animal Science and Technology,Xinjiang Production&Construction Corps,Alar 843300,China)

Strain SA isolated and screened in yogurt pimple produced by herdsmen from Aletai prefecture of Xinjiang,was preliminarily determined as a lactic acid bacterium by catalase tests.Strain SA was researched by colony and cell morphology,physiological and biochemical characteristics,16S rDNA gene sequences and phylogenetic tree analysis.The results showed that isolated strain SA was clustered into one class withWeissella cibariaKACC 11862 AEKT01000037,and the homology was 99%.Strain SA was identified asWeissella cibaria.The optimum growth conditions of strain SA was culture temperature 40℃and pH 6.0,it could tolerate 3%NaCl.

lactic acid bacteria;isolation;identification

Q815

0254-5071（2017）09-0116-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.025

2017-06-23

兵团科技创新中青年领军人才项目（2016BC001）；兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题项目（HS201613）

刘俊峰（1980-），男，副教授，硕士，研究方向为兽医药理与毒理学。

*通讯作者：郭雪峰（1980-），女，副教授，博士，研究方向为动物营养与饲料学。