清香型大曲酿酒酵母株系分类及其可挥发代谢产物分析

周 森，李艳敏，胡佳音，赵卫鹏，闻泽喜，窦 骁，魏金旺*

（1.北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京 101301；2.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000）

清香型大曲酿酒酵母株系分类及其可挥发代谢产物分析

周 森1，李艳敏1，胡佳音1，赵卫鹏1，闻泽喜1，窦 骁2，魏金旺1*

（1.北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京 101301；2.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000）

为解析牛栏山清香型大曲酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的遗传多样性和株系分类，研究了清香型大曲酿酒酵母的菌株分型，并对不同株系酿酒酵母进行了代谢产物分析。利用传统分离方法及聚合酶链反应（PCR）鉴定技术从牛栏山清香型大曲中分离酿酒酵母，对酿酒酵母IGS1区VR1/VR2片段进行单链构象多态性（SSCP）基因多态性分析和菌株分型，确定酿酒酵母种下的不同株系，并利用固态发酵实验分析不同株系酿酒酵母的可挥发代谢产物。结果表明，牛栏山清香大曲酿酒酵母可分为5个株系，其中一个数量较为优势，在模拟发酵中，5种酿酒酵母发酵产物主要为酸、醇、酯3大类共28种风味物质，其风味种类差异较小，但在乙酸、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、苯乙醇和壬酸乙酯生成量之间存在较大差异。

酿酒酵母；IGS1区；聚合酶链反应单链构象多态性；代谢产物

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种单细胞真菌，属于子囊菌门酵母纲酵母目酵母科酵母属，在自然界中分布甚广，是与人类关系最密切的酵母菌之一[1]。酿酒酵母中含有蛋白质、氨基酸、维生素、可食纤维以及微量元素等多种生理活性物质和营养成分，具有营养、保健和医疗等功能[2]。此外，酿酒酵母还是酒精饮料酿造的主要菌种，被广泛用于啤酒、葡萄酒及白酒等发酵行业，是发酵工业的一种重要微生物。在清香型白酒中，酿酒酵母是大曲众多微生物中的一种，在随大曲进入酒醅参与发酵后，能够通过糖酵解途径，将发酵环境中的糖类分解为二氧化碳和酒精[3]，是发酵过程中主要的产酒类微生物。在生成酒精的同时，酿酒酵母还能够生成多种有机酸、高级醇及酯类物质[4]，这些物质在基酒的风味中发挥重要作用。

目前，通过分子技术手段已经可以成熟的对酿酒酵母鉴定到分类学中的“种”的水平[5]，但酿酒酵母在“种”水平之下，依然存在多种类型[6]，这也就形成了虽然同为酿酒酵母，但代谢产物完全不同的现象。如郝欣等[7]对7株酿酒酵母发酵性能和高级醇生成量进行筛选实验，结果表明，7株酿酒酵母的异丁醇、异戊醇生成量存在明显差异。苏宁等[8]对本土优选的3株酿酒酵母同商业菌株进行中试酿酒实验，结果表明酿酒酵母发酵生成香气物质种类和含量上都无明显缺陷，且每个测试菌株都有其各自的特点。

IGS区是酵母核糖体基因的非转录区，是酵母核糖体基因变异最大的区域，它被5S rDNA分隔为IGS1和IGS2两个区域[9]。在酿酒酵母核糖体基因中，IGS1区包含了多个高变区，VR1/VR2片段是IGS1区中包含最大变异区域的一个＜200 bp的片段。

聚合酶链反应单链构象多态性（polymerase chainreaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）技术是利用脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）单链构象具有多态性进行基因检测的一种分析技术，其原理是：PCR扩增获得的双链DNA解链成单链DNA后，在非变剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，相同长度的DNA单链因其碱基序列不同所形成的空间构象不同，空间构象的不同会引起在电泳中迁移率的改变，会出现泳动变位，通过显色或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别，现已被广泛应用于各种基因多态性的研究中[10-11]。

目前，已有研究证明利用PCR-SSCP对酿酒酵母IGS1区进行基因多态性分析，可用于酿酒酵母的“种”下分型，如王士安[12]利用VR1/VR2片段对商业酿酒酵母进行分型，结果表明IGS1高变区域的VR1/VR2片段可用于酿酒酵母分型；韩培杰[13]利用VR1/VR2片段完成了传统面引子中酿酒酵母的分型研究。陈倩[14]以酵面中分离的酿酒酵母为研究对象，对其核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）基因间隔区IGS1中的高变区进行SSCP分析，结果表明民间酵面酿酒酵母菌具有很高的遗传多样性。

本研究以牛栏山清香大曲酿酒酵母为研究对象，对其IGS1区VR1/VR2片段进行SSCP基因多态性分析，进行“种”下分型，确定大曲中优势酿酒酵母，并对酿酒酵母进行风味测定，为筛选优良酿酒酵母奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

大曲：牛栏山酒厂清香型大曲。

1.1.2 试剂

三氯甲烷、异丙醇、氯仿、醋酸钾（均为分析纯）：北京化工厂；乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、0.5%十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，SDS）：上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 培养基

分离培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，琼脂4%，盐酸调节pH至3.0，煮沸15 min冷却后倾倒平板。倒平板前加入20 mg/L氯霉素，体积分数为5%乙醇，115℃灭菌20 min。

液体培养基采用YEPD液体培养基：蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，115℃灭菌30 min，接菌前加入20 mg/L氯霉素。

固体发酵培养基：高粱粉碎后按高粱∶水=1∶4的比例混匀，煮沸后纱布过滤去除液体，固体中加入液化酶，90℃保温1 h，随后冷却60℃加入糖化酶，保温糖化2 h，搅拌均匀后，称取40 g于250 mL磨口三角瓶中，115℃灭菌40 min。

1.2 仪器与设备

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜：北京东联哈尔仪器制造有限公司；C1000快速梯度基因扩增仪、Powerpac Basic基础电泳仪、GelDoc XR+BIO-RAD全自动凝胶成像系统、DCodeTM突变检测电泳仪：美国BIO-RAD公司；1-14k高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；7890B气相色谱仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲酿酒酵母分离

称取大曲样品10g（需要无菌操作）于90 mL无菌水中，拟定为10-1浓度，混匀后吸取1 mL液体接入9 mL无菌水中，标记为10-2，依次稀释为10-3、10-4、10-5、稀释浓度，分别吸取10-3、10-4、10-5稀释液0.1 mL，每个梯度分别涂布于分离培养基中。28℃培养3 d，随机挑取酵母菌进行平板纯化，纯化后单独保存[15]。

1.3.2 酿酒酵母的鉴定

挑取少量活化的酵母菌体，于灭过菌的1.5 mL离心管内；加入100 μL裂解液（100 mmol/L Tris，30 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.5%十二烷基硫酸钠（SDS），pH 8.0，0.1 MPa灭菌30 min备用；100 ℃水浴15 min；加入100 μL 2.5mol/L的醋酸钾溶液，冰浴60min；4℃条件下13000r/min离心5min，取上清液200μL至0.5mL离心管中；加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），剧烈振荡10 min，13 000 r/min离心15 min，移取100 μL上清液至0.5 mL离心管中；加入100 μL预冷的异丙醇，混匀后-20℃条件下放置20min；13000r/min离心15 min，弃去上清；用体积分数为70%的酒精洗涤沉淀两次；沉淀过夜自然干燥；加入50 μL已灭菌的超纯水，室温条件下溶解1 h，-20℃冰箱储藏备用。

PCR扩增酵母菌D1/D2区，所用引物及PCR条件如下：

NL1：5'-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG；NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG；PCR反应条件：94℃、3min；（94℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、45 s）35个循环；72 ℃、5 min，冷却至4℃。

PCR产物送公司测序后，用Chromas软件分析测序质量，去除峰图不可靠的部分对DNA序列进行手动校正，用校正后的序列在美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中进行同源序列搜索，比较该菌株在D1/D2序列上亲缘关系最近的已知酵母菌信息，包括模式菌株与实验菌株的碱基差异，近缘模式菌株GenBank序列号，可以根据序列同源性初步判断待测菌株的分类地位。

1.3.3 酿酒酵母核型分析

扩增20株酿酒酵母的IGS1区，引物及反应条件如下：

VR1-1：5'ATAGTGTGTAAGAGTGTACCATTT 3'；VR1-2：5'TCCATGAAGCAAACTGTCC3'；PCR反应条件：95 ℃、5 min；（94 ℃、45 s，52 ℃、45 s，72 ℃、20 s）循环30次；72℃、8 min，冷却至4℃。

PCR结束后对PCR产物进行单链样品制备，取5 μL（大约150～300 ng）与等量的上样缓冲液（0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青，95%甲酰胺，4%0.5 mol/L EDTA，pH8.0）混匀，在95℃变性5～10 min，迅速放在冰上，放置15 min。

SSCP电泳检测及染色参照文献[12]中的方法。

1.3.4 酿酒酵母风味测定

样品前处理：将酿酒酵母接入250 mL液体培养基中，30℃、150 r/min培养3 d，吸取4 mL发酵液加入固体培养基中，插入发酵栓后用5 mL2.61 mol/L硫酸封口，30℃培养箱静置培养7 d后，拔去发酵栓，加入40 mL色谱纯无水乙醇，超声萃取40min后，吸取上清5mL，12000r/min离心20min，0.4 μm滤膜过滤后进行气相色谱分析。

气相色谱条件：进样口温度250℃、进样量0.5 μL、分流比30∶1、柱箱升温程序为35℃（1 min），2℃/min升至100℃，3℃/min升至230℃（10min）、CPwax58色谱柱（50m×0.2 mm×0.2 μm）、检测器温度：280℃。

2 结果与分析

2.1 大曲酿酒酵母分离及鉴定

图1 大曲中酵母的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of isolated yeasts from Daqu

大曲稀释涂布后，根据酿酒酵母形态特征，随机挑选形态呈圆形、乳白色、菌落平坦稍凸起生长、有湿润感、光滑、边缘整齐的单菌落进行纯化，共计挑选出疑似酿酒酵母菌株30株编号为JM-1～JM-30。PCR鉴定及比对后，用MEGA5.0软件构建系统发育树，进行聚类分析，得到酵母菌系统发育树结果如图1所示，在所分离的30株酵母中，含有异常汉逊酵母（Hansenula anomala）6株，扁平云假丝酵母（Candida humilis）4株，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）20株。

2.2 酿酒酵母核型分析

对鉴定后的20株酿酒酵母进行编号整理，标记为1#～20#，PCR扩增上述酿酒酵母的VR1-1和VR1-2片段，PCR产物进行SSCP电泳分析。

图2 20株酿酒酵母SSCP电泳分析图Fig.2 SSCP profile of 20 strainsSaccharomyces cerevisiae

由图2可知，20株大曲酿酒酵母经过SSCP电泳分析后，可以将大曲中酿酒酵母分为5大类。分别为1#、2#、3#、4#～16#和17#～20#。其中4#～16#是大曲中数量较多的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在所分析的20株酿酒酵母中共有13株属于此类。17#～20#其次，共有4株酿酒酵母属于此类。1#、2#和3#最少，只有一株。

2.3 酿酒酵母风味测定结果

根据酿酒酵母分型结果，从5种类型中各挑选一株酿酒酵母进行模拟固体发酵及风味测定，挑选菌种为1#、2#、3#、7#和18#。将5株酿酒酵母固态发酵产物及空白培养基（对照样品）进行酒精超声萃取，萃取液离心过滤后进行风味分析，结果见表1。

由表1所示，酿酒酵母发酵产物主要为酸、醇、酯3大类共28种风味物质[16]，其中酸类11种，醇类6种，酯类11种。

酸类物质是牛栏山二锅头酒香气的主要协调成分，适量的酸有助于酒体的放香舒适性[17]。酿酒酵母代谢产生中共生成11种有机酸，同对照相比，增长较多的有机酸主要为乙酸、异戊酸、2-甲基丙酸、庚酸和辛酸。其中，1#酵母是生成乙酸最多的酿酒酵母，达到了824.02 mg/L，同对照相比增长了123%，而其余酿酒酵母乙酸含量均出现了降低；7#酵母生成异戊酸含量为171.75mg/L，是异戊醇增长量最高的酿酒酵母；除18#酵母外，其余酵母都表现出较高的生成2-甲基丙酸的能力，生成量分别达到了114.78 mg/L、159.24 mg/L、154.84mg/L和141.44mg/L，远远高于对照样品的14.12mg/L；5种酿酒酵母均具有合成庚酸的能力，同对照相比，分别提高了38%、74%、63.4%、70.7%、64.65%；18#具有较强的合成辛酸的能力含量可达到46.85 mg/L。而其余十六酸、癸酸、壬酸、丙酸、十二酸、己酸这几类酸类虽然在酿酒酵母代谢产物中能够检测到，但其含量低于空白对照组，故不认为其具有高产这几类有机酸的能力。

表1 酿酒酵母模拟发酵试验风味物质检测结果Table 1 Flavor compounds detection results of the simulated fermentation experiments ofS.cerevisiae mg/L

醇类物质是牛栏山二锅头酒体香气的重要成分，其能够赋予酒体醇香、水果香。酿酒酵母产物中共检测出6种醇类，其中3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇和正丙醇是生成量较多的醇类物质，而甲醇和壬醇只在3#和18#酿酒酵母中出现，且含量仅为3.83 mg/L和0.86 mg/L；在含量较多的4种醇类风味中，正丙醇生成量差异较小，5种酿酒酵母正丙醇生成量在19.42～23.60 mg/L之间；同时，5种酿酒酵母在合成3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇上呈现一定规律性，1#是这几种醇类生成量最少的酿酒酵母，这3种醇类生成量分别为55.54 mg/L、18.81 mg/L和12.49 mg/L，其次是18#，而2#、3#和7#这3种醇类生成量相对较高，且数值较为接近，如3-甲基丁醇生成量在104.25～110.57 mg/L，苯乙醇含量在57.88～60.63 mg/L，2-甲基丙醇含量在45.89～47.69 mg/L，其含量远高于1#和18#。

酯类物质是牛栏山二锅头的重要呈香成分，大部分表现为水果香、花香[18]。酿酒酵母产物中共检测出11种酯类物质，同对照相比，壬酸乙酯是生成量最高的酯类物质，5种酿酒酵母生成壬酸乙酯含量分别为172.64 mg/L、69.42 mg/L、74.77 mg/L、70.57 mg/L和50.73 mg/L，远高于对照样品的5.47 mg/L；亚油酸乙酯同样属于增长量较高的酯类物质且5种酿酒酵母生成量较为接近，其含量由对照组的1.23mg/L增长至30.05～36.32 mg/L；油酸乙酯、十六酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸异戊酯和丁二酸二乙酯这5种酯类虽然出现增长，但含量较低，如油酸乙酯最高含量仅为3#的13.92 mg/L，十六酸乙酯最高为7#的9.75mg/L。而乙酸苯乙酯、乳酸异戊酯、十七酸乙酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯这5种酯类同对照相比生成量较少或只有个别酵母产生，故不进行讨论。

3 结论

从牛栏山清香型大曲中共分离鉴定20株酿酒酵母，利用PCR-SSCP技术对酿酒酵母IGS1区进行“种”下分型，将大曲中酿酒酵母分为5大类型，其中一种类型在数量上较为优势。通过对酿酒酵母风味分析可以看出，酿酒酵母除可产生酒精外，还具有生成酸类、醇类和酯类化合物的能力。本次实验中共检测到酸、醇、酯三大类共计28种化合物，其中酸类中的乙酸、2-甲基丙酸，醇类中的3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇，酯类中的壬酸乙酯和亚油酸乙酯是生成量增长较多的化合物。通过对不同类型酿酒酵母风味比较可以看出，不同类型酿酒酵母生成的风味物质种类较为一致，但生成量之间存在一定差距，如1#具有较强的产乙酸和壬酸乙酯的能力，其含量分别为824.02 mg/L和172.64 mg/L；18#产2-甲基丙酸能力较弱，仅为37.21 mg/L；2#、3#和7#生成3-甲基丁醇量在104.25～110.57 mg/L，远高于1#和18#的55.54 mg/L和66.70 mg/L。

综上所示，本研究利用PCR-SSCP技术结合IGS1区片段对牛栏山大曲中酿酒酵母进行“种”下分型并进行模拟发酵风味测定。较为系统的对大曲中酿酒酵母进行分类，确定了大曲中酿酒酵母的“种”下组成，并根据酿酒酵母的风味分析结果，获得了不同酿酒酵母代谢风味的差异。将2种技术手段相结合可以有助于更为简便、有效地筛选产香能力优秀的酿酒酵母，为下一步酿酒酵母强化添加，提高基酒风味打基础。

[1]严 易，张星玥，和 渊.糖的种类和浓度对酿酒酵母生长的影响[J].生物学通报，2016，51（3）：52-53.

[2]王卫国，张仟伟，赵永亮，等.酿酒酵母的选育及其应用研究进展[J].河南工业大学学报，2015，36（6）：104-112.

[3]孔德翀，杨雪莲，严 明，等.酿酒酵母糖酵解途径中酶量变化对乙醇浓度影响的模拟分析[J].生物工程学报，2007，23（2）：332-336.

[4]宋 钢.微生物代谢与香气成分[J].中国酿造，2006，25（2）：64-68.

[5]李金霞，刘光全，程 池.酿酒酵母26S rDNA D1/D2区域序列分析及其系统发育研究[J].酿酒，2007，34（1）：37-39.

[6]白逢彦，贾建华.脉冲电泳核型分析与酿酒酵母菌分类学研究中的应用[J].微生物学报，2000，40（1）：9-13.

[7]郝 欣，肖冬光，申 童，等.低产高级醇酿酒酵母菌株筛选及其单倍体制备[J].酿酒科技，2010（6）：35-38.

[8]苏 宁，李双石，严 斌，等.河北产区优选酿酒酵母的中试研究[J].中国酿造，2011，30（6）：34-37.

[9]刘 宁，刘延琳.核糖体RNA基因在酵母分类鉴定中的应用[J].中国农业科学，2014，43（22）：4701-4708.

[10]桂 芳，张卓然.PCR-SSCP技术及其在微生物学研究中的应用[J].微生物学杂志，2005，25（1）：89-93.

[11]李玉梅，姚纪元，吴 静，等.PCR-SSCP技术的研究及应用进展[J].生物技术通报，2007（6）：71-74.

[12]王士安.酿酒酵母种群分析及相关生境酵母菌物种多样性初探[D].北京：中国科学院微生物所，2008.

[13]韩培杰.中国民间面引子中酿酒酵母遗传多样性和抗逆性研究[D].福建：福建农业大学，2013.

[14]陈 倩.民间酵面及相关基物种酿酒酵母菌的遗传多样性和群体分化研究[D].哈尔滨：黑龙江大学，2012.

[15]胡佳音，周 森，赵卫鹏，等.清、浓、酱三种大曲真菌多样性初步分析[J].酿酒科技，2016（8）：87-90.

[16]徐 岩，范文来，吴 群.清香类型原酒共性与个性成分分析及形成机理研究[J].酿酒，2012，39（1）：107-112.

[17]王 勇，范文来，徐 岩，等.液液萃取和顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术分析牛栏山二锅头酒中的挥发性物质[J].酿酒科技，2008（8）：99-103.

[18]王 勇，徐 岩，范文来，等.应用GC-O技术分析牛栏山二锅头白酒的香气化合物[J].酿酒科技，2011（2）：74-76.

Strain classification and volatile metabolites analysis ofSaccharomyces cerevisiaefrom light-flavor Daqu

ZHOU Sen1,LI Yanmin1,HU Jiayin1,ZHAO Weipeng1,WEN Zexi1,DOU Xiao2,WEI Jinwang1*
(1.Beijing Shun Xin Agriculture Co.,Ltd.,Niulanshan Distillery,Beijing 101301,China;2.School of Bioengineering,Sichuan University of Science＆Engineering,Zigong 643000,China)

In order to analyze genetic diversity and strain classification ofSaccharomyces cerevisiaefrom Niulanshan light-flavor Daqu,the strain types and metabolite ofS.cerevisiaewere researched.By traditional separation methods and polymerase chain reaction(PCR)identification technique,S.cerevisiaewas separated from Niulanshan light-flavor Daqu,the gene polymorphism of single strand conformation polymorphism ofS.cerevisiae IGS1 region VR1/VR2 fragment was analyzed.The different strains ofS.cerevisiaewere determined and their volatile metabolites were analyzed by solid state fermentation experiments.The results showed that theS.cerevisiaefrom Niulanshan light-flavor Daqu could be divided into 5 strains,one of which was superior.In the simulated fermentation experiments,the fermentation products of 5S.cerevisiaestrains were mainly 28 kinds of flavor compounds in three major categories(such as acids,alcohols and esters).There was no significant difference between the types of flavor components.But the yield of acetic acid,3-methylbutanol,2-methylpropanol,phenylethyl alcohol and ethyl pelargonate had great differences.

Saccharomyces cerevisiae;IGS1 region;PCR-SSCP;metabolite

TS262.3

0254-5071（2017）09-0137-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.030

2017-06-09

周 森（1986-），男，工程师，本科，研究方向为白酒酿造微生物。

*通讯作者：魏金旺（1971-），男，本科，研究方向为白酒酿造微生物。