藏药诃子的质量标准提高研究

成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

药物研究

藏药诃子的质量标准提高研究

邓星苟立平温倩雯罗莉娅万丽*

成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

目的提高诃子的质量标准。方法以没食子酸、诃子对照药材为对照，新增薄层色谱-生物自显影鉴别；建立HPLC测定没食子酸含量的方法，采用Phenomenex luna C18 色谱柱(250mm × 4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(5:95)；流速1.0 mL / min；柱温30 ℃；检测波长 271 nm；进样量10 μL。结果薄层色谱-生物自显影法鉴别斑点清晰，分离度好，不仅能对诃子进行定性鉴别，还能体现其抗氧化活性；在以上HPLC条件下，没食子酸在10.72～85.76 μg呈良好线性关系，线性回归方程为Y= 31.248X+ 9.037(r=0.9997)，平均回收率96.1%(RSD2.54)。结论新增的方法简单易行，专属性强，重复性好，可用于诃子的质量控制。

诃子；薄层色谱-生物自显影鉴别；含量测定；质量标准

诃子是习用藏、蒙药之一，被称为“药中之王”，为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz. 或绒毛诃子TerminaliachebulaRetz, var. tomentella Kurt. 的干燥成熟果实，具有良好的涩肠止泻，敛肺止咳，降火利咽功效[1]。始载于《新修本草》。诃子主要成分为鞣质类、多元酚类、黄酮类、三萜类[2]，鞣质类中的没食子酸为其活性成分，具有抗菌、收敛、止血等功用[3]。2015年版《中国药典》一部只收载了性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别，且操作繁琐，费时费力，虽然有学者已对诃子进行质量标准研究[4]，建立了诃子水解产物没食子酸高效液相色谱含量测定法，但是该方法并不适用于控制目前大多数含诃子的成方制剂的质量，与成方制剂测定的没食子酸不一致，如三果汤散、三果汤胶囊、洁白丸、西青果颗粒等含诃子的制剂是测定没食子酸含量并非是水解鞣质后得到的总没食子酸。因此，诃子的质量标准有必要进一步修订及提高，本实验采用HPLC对诃子药材中没食子酸进行含量测定，以保证含诃子制剂投料的安全、有效。

薄层色谱-生物自显影是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，具有操作简单、耗费低、灵敏度高和专属性强等优点是一种快速测定生物活性的方法[5]。DPPH法薄层色谱-生物自显影技术中，DPPH 与具有抗氧化活性的物质结合，生成DPPH-H 而呈现白色或淡黄色，薄层板本身显紫色，从而筛选出抗氧化活性组分[6]。本实验对不同来源的诃子药材进行薄层色谱一生物自显影研究，结合常规薄层色谱检识方法，能对抗氧化活性成分没食子酸进行快速鉴别，达到定性和抗氧化活性检测的双重目的。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200 series 高效液相色谱仪、DAD 紫外检测器(G1315D)、Agilent Technologies 色谱工作站(美国 Agilent 公司)；KQ3200E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器公司)；UPT-II-10T优普系列超纯水器(成都超纯科技有限公司)；HX-200型高速中药粉碎机(浙江省安康市溪岸五金药具厂)； 101c-2型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)；双槽展开缸 ( 20cm×10cm) ；BSA-124S(万分之一)、BT125D(十万分之一)电子天平(德国 Sartorius 公司)；定量毛细管。

1.2 材料 10批不同来源诃子药材，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz. 或绒毛诃子TerminaliachebulaRetz,var.TomentellaKurt. 的干燥成熟果实，不同来源诃子药材见表1。诃子对照药材(批号：121015-201302，中国食品药品检定研究院)；没食子酸(批号：110831-201605，质量分数90.8%，中国食品药品检定研究院)；1,1-二苯基苦基苯肼( 1,1 -diphenyl -2- picrylhydrazyl，DPPH ) (CAS：1898-66-4，Sigma 公司)；5 %三氯化铁乙醇溶液；聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 诃子各样品来源

续表

表1 诃子各样品来源

2 方法与结果

2.1 薄层色谱-生物自显影鉴别

2.1.1 DPPH显色剂溶液 取DPPH 0.04 g,溶于50 mL无水乙醇溶液中,即得0.08 %DPPH无水乙醇溶液,避光冷藏保存。

2.1.2 对照品溶液的制备 取诃子对照药材3g,加入乙醇10mL,超声30min,取上清液，即得；称取没食子对照品适量，加乙醇配成0.5mg/mL的对照品溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取不用来源的诃子粉末 3 g,加入乙醇10mL,超声30 min,取上清液，即得。

2.1.4 点样量考察 分别对照品及供试品溶液1、2、3μL进行考察。以乙酸乙酯-甲酸(3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.08 %DPPH无水乙醇溶液，置于40 ℃烘箱内显色30 min，于日光下检视。结果表明没食子酸对照品溶液点样量为以1 μL，供试品溶液点样量为1μL较好，斑点圆整，清晰。故确定为对照品点样量1μL，供试品点样量1μL。

2.1.5 温度考察 将薄层鉴别实验在不同的环境温度下展开，考察温度变化对薄层鉴别实验的影响。分别取对照品溶液、供试品溶液点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲酸(3:1)为展开剂,分别在8℃、25 ℃、35 ℃条件下展开，取出，晾干，喷以0.08 %DPPH无水乙醇溶液，置于40 ℃烘箱内显色30 min，于日光下检视，结果表明在不同温度条件下，对诃子供试品均能起到很好的分离效果。

2.1.6 湿度考察 将薄层鉴别实验在不同的环境湿度下展开，考察湿度变化对薄层鉴别实验的影响。分别取对照品溶液、供试品溶液点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲酸(3:1)为展开剂，分别在为32 %、72 %条件下展开，取出，晾干，喷以0.08 %DPPH无水乙醇溶液，置于40 ℃烘箱内显色30min，于日光下检视，结果表明在不同湿度条件下，对诃子供试品均能起到很好的分离效果，表明该鉴别方法耐用性良好。

2.1.7 不同批次诃子薄层色谱-生物自显影鉴别 对10批不同来源诃子进行薄层色谱-生物自显影鉴别，点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲酸(3:1)为展开剂[7]，展开，取出，晾干，喷以0.08 %DPPH无水乙醇溶液，置于40 ℃烘箱内显色30 min，于日光下检视，薄层色谱-生物自显影图谱，如图1所示。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex luna C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(5:95)；检测波长271nm；流速 1. 0mL/min；柱温30 ℃；进样量10μL。对照品和供试品HPLC图如图2所示。

2.2.2 对照品溶液、供试品溶液的制备 取没食子酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

取本品粉末(过三号筛)0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇80 mL，称定重量，70 ℃加热回流1 h，放冷，再称定重量，用 50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 线性关系考察 精密量取上述对照品溶液1、2、4、6、8 mL分别置于10 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，配制成系列浓度的对照品溶液。分别吸取各个浓度的对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”色谱条件测定峰面积。以质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y= 31.248X+ 9.037，r=0.9997。结果表明，没食子酸在10.72～85.76 μg/mL成良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 精密吸取没食子酸对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，计算没食子酸峰面积的RSD值。结果显示，RSD为0.02，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，在0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定含量，结果显示，RSD为1.60，表明没食子酸在24 h 之内含量稳定。

2.2.6 重复性试验 按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示，没食子酸质量分数9.75 mg/g，RSD为2.3，表明该方法重复性良好。

2.2.7 耐用性试验 以三种不同品牌色谱柱Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm) 和 Inertsil ODS-3(250mm×4. 6mm，5μm)按“2.2.1”色谱条件测定，没食子酸百分含量结果分别为0.95%，0.97%，0.98%；28 ℃、30 ℃和32 ℃不同温度条件下测定结果分别为0.96%，0.97%，0.97%；0.9mL/min，1.0mL/min，1.1mL/min不同流速条件下测定结果分别为0.95%，0.98%，0.97%。结果表明，在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响且满足系统适用性试验要求，可认为该方法具有可靠性。

2.2.8 加样回收率试验 取上述样品粉末6份，各0.1 g，精密称定。另取没食子酸对照品用50%甲醇制成每1 mL含1.001 mg的溶液。分别准确加入没食子酸对照品溶液1 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测进行定，计算没食子酸平均加样回收率为96.1%，RSD为2.54 。结果见表2。

2.2.9 样品测定 取不同来源的诃子粉末( 过3 号筛) 0.2 g，精密测定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果显示平均含量为1.02 %。拟定本品按干燥品计算，含没食子酸不得少于0.8% 。结果见表3。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

表3 10批诃子药材中没食子酸含量测定结果( 按干燥品计)

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别项优化 研究发现,硅胶G板对于诃子药材的分离效果较差,拖尾较为严重。聚酰胺色谱的分配原理为氢键吸附,诃子主要含有多羟基的有机酸类化合物。采用聚酰胺薄膜能较好的对毛诃子药材进行分离,且斑点较为清晰。本实验采用溶剂作空白对照，无任何斑点干扰。薄层色谱-生物自显影图既反映了诃子药材中没食子酸成分的有无，实现了传统薄层鉴别目的，又通过斑点的大小体现出这种成分的活性强弱，并且能发现诃子中还存在其他活性成分。在鉴别诃子药材真伪的同时还能评价其相关活性成分，以达到质量控制与活性筛选两个目的。该技术将诃子中化学成分的分离与活性评价有机结合，它不仅是只针对单一成分，所以能更多的反映出诃子的内在质量，在对诃子进行鉴别时可以将薄层-生物自显影鉴别和传统薄层鉴别相结合，进一步丰富诃子的薄层鉴别方法，为诃子的质量控制提供更加科学的依据。

3.2 含量测定项 没食酸在(215±1) nm和(271±1)nm波长处都有最大吸收，215nm接近末端吸收，故选择271nm为测定波长。采用“2.2.1”项下色谱条件可以使分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，具有良好的分离效果。共收集10批不用来源的诃子，拟定本品按干燥品计算，含没食子酸不得少于1.02 %。本实验建立的HPLC测定诃子没食子酸含量方法既可以实现控制诃子药材的质量，又适用于控制当前测定非鞣质水解总没食子酸含量的诃子成方制剂的质量，因此，表明该质量标准具有可行性。

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社,2015:187.

[2]刘芳，秦红飞，刘松青．诃子化学成分与药理活性研究进展[J].中国药房，2012，23(7) : 670．

[3]丁冈，刘延泽，韩全斌．诃子属植物化学成分与生物活性研究进展[J]．现代药物与临床，1996，11(6) : 255．

[4]卢平华，颜玉贞. 诃子质量标准研究[J]. 中药新药与临床药理, 2002, 13(6): 385-388.

[5]李绍平，赵静，钱正明，等.色谱技术在中药有效成分辨识中的应用进展[J].中国科学,2010,40(6):651-667.

[6]Corrado M, Rodrigues K F. Antmiicrobial evaluation of fungal extracts produced by entophytic strains of Phomopsis sp.[J].J Basic Microbiol, 2004(44):157.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典中药材薄层色谱彩色图集(一部)[M].北京: 人民卫生出版社,2009:399.

ResearchontheImprovementofQualityStandardsofTerminaliachebulaRetz.

DENG Xing WEN Qianwen LUO Liya GOU Liping WAN Li*

School of Pharmacy, Chengdu University of TCM, Chengdu 611137, China

ObjectiveTo improve the quality standards ofTerminaliachebulaRetz.MethodsNew additions to TLC-Bioautography method is based on gallic acid and control herbs as contrast, and combined with traditional TLC identification method for rapid qualitative identification ofTerminaliachebulaRetz. The contents of gallic acid was determined by HPLC.Gallic acid were separated on a phenomenex luna C18 column(250mm×4.6mm,5μm ),using methanol-0.1% phosphoric acid (5:95) as the mobile Phase at a flow rate of 1.0 mL/ min.The column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was 271 nm.The injection volume is 10 μL.ResultsThe spots in TLC were clear and well-separated.Not only on theTerminaliachebulaRetz for qualitative identification, but also reflect its antioxidant activity.The methodology validation for the assay of gallic acid presented that it was in good linear correlation in the ranges of 10.72～85.76 μg with the regression equations ofY= 31.248X+ 9.037(r=0.9997),and the average recoveries were 96.1%(RSD2.54%).ConclusionThese methods are simple, easy,strongly specific and good repeatability,which can be used for the quality control ofTerminaliachebulaRetz.

TerminaliachebulaRetz.;TLC-Bioautography;HPLC;Quality Standard

R284.1

A

1007-8517(2017)18-0012-04

2017-07-11： 编辑：梁志庆)

国家自然科学基金资助项目(81673653)。

邓星(1993-)，女，汉族，硕士研究生，研究方向为中药有效成分分析。E-mail：602079822@qq.com

万丽(1965-)女，汉族，教授，博士生导师，研究方向为中药分析研究。E-mail：wanli8801@163.com