青钱柳降糖组方对2型糖尿病大鼠的治疗作用*

江新湄， 林秋雄， 何国东， 侯兴华， 单志新， 杜耀民

(1佛山市南海经济开发区人民医院妇产科， 广东 佛山 528222； 广东省人民医院， 广东省医学科学院 2医学研究中心， 3内科， 广东 广州 510080)

青钱柳降糖组方对2型糖尿病大鼠的治疗作用*

江新湄1， 林秋雄2▲， 何国东2， 侯兴华2， 单志新2， 杜耀民3△

(1佛山市南海经济开发区人民医院妇产科， 广东 佛山 528222； 广东省人民医院， 广东省医学科学院2医学研究中心，3内科， 广东 广州 510080)

目的探讨青钱柳降糖组方(QQL组方)对2型糖尿病模型大鼠的治疗效果。方法随机抽取10只大鼠作为正常对照组, 其余大鼠采用高脂饮食联合链脲霉素诱发2型糖尿病大鼠模型。成模大鼠随机分为中药高(300 mg·kg-1·d-1)、中(150 mg·kg-1·d-1)、低(75 mg·kg-1·d-1)剂量组和模型对照组，每组10只。各给药组每日给予相应药物灌胃，连续6周。观察QQL组方对糖尿病大鼠体重、血糖、血清胰岛素、糖化血红蛋白、抗氧化指标和炎症因子的影响。结果与模型对照组比较，QQL组方中、高剂量组大鼠的体重增加，血糖下降，血清胰岛素含量升高，糖化血红蛋白含量降低，血糖曲线下面积减少，胰岛组织损伤减轻，血清SOD和GSH增加，MDA、IL-1β和TNF-α水平降低。结论QQL组方对2型糖尿病大鼠高血糖症状和糖耐受情况有改善作用，对胰岛组织有保护作用，其机制可能与其抗氧化和抗炎作用有关。

青钱柳叶； 降糖药； 2型糖尿病； 胰岛素

青钱柳降糖组方(QQL组方)由青钱柳叶、桑白皮、石斛、陈皮组成。青钱柳是我国珍稀的植物，也是一种极具开发潜力的药用植物，尤其在治疗糖尿病方面有其独特的作用。民间使用历史悠久，认为具有保健功效，多以其叶作甜茶饮用。现代研究表明青钱柳叶(Cyclocaryapaliurus)具有甘甜滋润、生津止渴、降血糖、降血压、延年益寿等功效，可用于治疗糖尿病、高血压、神经衰弱等[1]；青钱柳叶中的糖类、黄酮类、三萜类、皂苷类、甾体类及内酯成分有较显著的降血糖作用，另外，一些微量元素也与降血糖有关[2]。据《中药志》记载，石斛有“养阴益胃，生津止渴”的功效；在治疗糖尿病的中药方剂中也有采用石斛的组方；研究表明石斛能够上调体外培养大鼠肝细胞胰岛素信号传导通路上InsR、IRS-2基因表达和InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平[3]。《本草纲目》记载桑白皮有治疗消渴尿多症的作用；文献报道桑白皮有降血糖、降血压、抗肿瘤等作用[4]。现代研究表明陈皮对高血压和高血糖有一定的食疗作用[5]。本研究探讨青钱柳降糖组方对2型糖尿病大鼠的治疗作用

材 料 和 方 法

1材料

1.1试剂 链脲霉素(streptocin，STZ)购于Sigma；胰岛素、糖化血红蛋白、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、IL-1β和TNF-α检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2仪器 W-80A漩涡混合器(上海医大仪器厂)；pl303电子天平(Mettler Toledo)；强生稳豪血糖仪(强生中国医疗器材有限公司)。

1.3QQL组方样品的制备 成人1日使用处方量：青钱柳叶2 g、桑白皮1.5 g、石斛1.5 g和陈皮1 g，混合煮沸提取2次；第1次加15倍量水，提取2 h； 第2次加12倍量水，提取1 h。合并提取液，200目筛过滤，浓缩、烘干，烘干粉提取得率15%左右。

1.4动物饲料 普通饲料：玉米粉80%，面粉15%，黄豆粉5%；高脂饲料：79%普通饲料+1%胆固醇+15%鲜蛋黄+5%猪油。

1.5实验动物和分组 SPF级5～6周龄Wistar雄性大鼠70只，体重160～180 g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(粤)2011-0015。动物于SPF级屏障动物房饲养，动物使用许可证号为SYXK(粤)2012-0081。适应性普通饲料喂养1周，随机取10只作为正常对照(normal control)组，以普通饲料喂养；60只作为模型组，以高脂饲料喂养。自由进水, 室温控制在18～22 ℃, 相对湿度30%～70%。每日投食3次，每日饲料量为体重的3%。模型组造模成功后随机分为模型对照(model control)组以及QQL组方低剂量(low-dose QQL)组、中剂量(medium-dose QQL)组和高剂量(high-dose QQL)组，每组10只。

2方法

2.1造模 模型组高脂饲料喂养1个月，抽查血脂指标明显升高后，腹腔注射STZ (35 mg/kg)诱发糖尿病模型(STZ临用前用0.1 mmol/L、pH 4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液配成6 g/L的溶液，且在60 min内用完)。于注射后第7天，断尾采集空腹静脉血，以血糖值大于等于7.8 mmol/L为建模成功。

2.2剂量设定与给药 QQL组方成人使用烘干粉量为0.9 g/d，则60 kg人体推荐量为15 mg·kg-1·d-1。大鼠低、中、高剂量组分别为人体推荐量的5倍、10倍和20倍，即低剂量组给予75 mg·kg-1·d-1，中剂量组给予150 mg·kg-1·d-1，高剂量组给予300 mg·kg-1·d-1，模型对照组给予等体积蒸馏水灌胃。每天给药1次，连继6周。

2.3动物体重 每2周记录大鼠体重。

2.4血糖值测定 于给药前以及给药后2周、4周和6周进行血糖测定。大鼠尾尖用乙醇消毒后取血，用血糖试纸蘸取血液，放入血糖仪，记录血糖值。

2.5血清胰岛素和糖化血红蛋白含量的测定 于实验结束时采血，分别采用试剂盒进行血清胰岛素和糖化血红蛋白含量检测。

2.6糖耐量试验 于实验结束前 2 d 进行。动物禁食12 h，各组给予不同浓度受试样品，15～20 min后灌胃给予葡萄糖2.0 g/kg，于给予葡萄糖后0、0.5和2 h分别测定各组大鼠的血糖值，观察各组给予葡萄糖后不同时点血糖曲线下面积的变化。血糖曲线下面积=0.25×(0 h血糖值+4×0.5 h血糖值+3×2 h血糖值)。

2.7大鼠胰岛组织病理学观察 实验结束时处死大鼠，取胰腺组织置10%中性甲醛固定，常规组织包埋、石蜡切片、HE染色，显微镜下观察。

2.8血清抗氧化指标及炎症因子检测 分别采用试剂盒进行血清SOD、GSH、MDA、IL-1β和TNF-α检测。

3统计学处理

实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较用ANOVA方法进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1QQL组方对大鼠体重的影响

与正常对照组比较，经STZ诱发的2型糖尿病模型大鼠体重明显减轻(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组比较，QQL组方中、高剂量组用药4周后可明显改善大鼠体重降低(P<0.05或P<0.01)，其它各组大鼠体重的差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1. Effect of QQL prescription on the body weight of the rats. Mean±SD.n=10.#P<0.05,##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel control group.

图1QQL组方对大鼠体重的影响

2QQL组方对2型糖尿病大鼠血糖的影响

与正常对照组比较，给药前各组糖尿病模型大鼠血糖显著升高，表明糖尿病模型造模成功。与模型对照组比较，QQL组方低、中和高剂量组大鼠血糖分别在给药6周、4周和2周后开始显著下降(P<0.05或P<0.01)，见图2。

Figure 2. Effect of QQL prescription on blood glucose in type 2 diabetic rats. Mean±SD.n=10.#P<0.05,##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel control group.

图2QQL组方对2型糖尿病大鼠血糖的影响

3QQL组方对2型糖尿病大鼠血清胰岛素、糖化血红蛋白和血糖曲线下面积的影响

与正常对照组比较，模型对照组和QQL组方各剂量组大鼠糖化血红蛋白和血糖曲线下面积均明显升高(P<0.01)，而血清胰岛素均明显下降(P<0.01)；与模型对照组比较，QQL组方中剂量组和高剂量组大鼠糖化血红蛋白和血糖曲线下面积均显著下降(P<0.05或P<0.01)，而血清胰岛素均明显升高(P<0.05或P<0.01)，见图3、4。

Figure 3. Effect of QQL prescription on serum insulin and glycosylated hemoglobin in type 2 diabetic rats. Mean±SD.n=10.#P<0.05,##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05，**P<0.01vsmodel control group.

图3QQL组方对2型糖尿病大鼠血清胰岛素和糖化血红蛋白的影响

Figure 4. Effect of QQL prescription on the area under the blood glucose curve in type 2 diabetic rats. Mean±SD.n=10.##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel control group.

图4QQL组方对2型糖尿病大鼠血糖曲线下面积的影响

4QQL组方对2型糖尿病大鼠胰岛病理组织学的影响

正常对照组大鼠胰腺组织的胰岛数量丰富，分布均匀，呈圆形、椭圆形或条索状细胞团，界限清晰；胰岛细胞排列整齐，形态饱满呈球形，无变性细胞，核染色正常，血窦丰富。模型对照组大鼠胰腺组织胰岛数量最少、分布不均匀、变小、形态不规则，与周围腺泡分界不清晰；胰岛细胞排列紊乱、萎缩，可见空泡变性，部分细胞核深染或染色不清。持续给予QQL组方治疗6周后与模型对照组比较，中、高剂量组大鼠胰腺组织的胰岛数量相对增多，胰岛分布尚均匀，与周围腺泡分界较清晰，胰岛细胞萎缩现象有改善，胞浆增加，空泡变性减少，见图5。

Figure 5. Effect of QQL on the islets histomorphology in type 2 diabetes rats (HE staining, ×100). A： normal control group; B: model control group; C: low-dose QQL group; D: medium-dose QQL group; E: high-dose QQL group.

图5QQL组方对2型糖尿病大鼠胰岛病理组织学的影响

5QQL组方对2型糖尿病大鼠血清抗氧化指标的影响

与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清抗氧化指标SOD和GSH水平显著降低(P<0.01)，氧化产物MDA含量显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较，QQL组方中、高剂量组血清MDA含量显著降低，GSH显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，QQL组方中剂量SOD有升高的趋势，差异无统计学意义，高剂量组SOD显著升高，差异有统计学意义(P< 0.05)，见图6。

6QQL组方对2型糖尿病大鼠血清炎症因子的影响

与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较， QQL组方中剂量组血清IL-1β和TNF-β水平有降低的趋势，差异无统计学意义，高剂量组血清IL-1β和TNF-α水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图7。

讨 论

糖尿病在传统中医早有记载，称为消渴症。在消渴症的症状描述有隋代的巢元方在《诸病源候论·消渴候》中的论述：“夫消渴者，渴不止，小便多是也。渴利者，随饮小便故也”。《古今录验方》中论述：“渴而饮水多，小便数，有脂，似铁片甜者，皆是消渴也”这也是中医对糖尿病归属为“消渴”症的依据。在治疗方面，《内经》中有述“三消者，其归于燥热一也”，治拟“补肾水阴寒之虚，而泄心火阳热之实，除肠胃燥热之甚，济人身津液之衰。” 朱丹溪进一步把治疗消渴总结为：“养肺、降火、生血为主。”现代中医对消渴症病机认识主流也是以阴虚燥热为主，基于阴虚燥热病机的治疗多以滋阴清热之法为主[6]。

Figure 6. Effect of QQL prescription on serum antioxidative indexes in type 2 diabetic rats. Mean±SD.n=10.##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05vsmodel control group.

图6QQL组方对2型糖尿病大鼠血清抗氧化指标的影响

Figure 7. Effect of QQL prescription on serum inflammatory factors in type 2 diabetic rats. Mean±SD.n=10.##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05vsmodel control group.

图7QQL组方对2型糖尿病大鼠血清炎症因子的影响

QQL组方基于糖尿病的“阴虚燥热”病机进行组方，组方中所含青钱柳叶、石斛、桑白皮。青钱柳又名青钱李，胡桃科青钱柳属植物，是中国特有的单种属植物[7]。据《中国中药志要》记载，其树皮、树叶具有清热解毒、止痛功能，这种树叶泡出的茶汤甘甜滋润，生津止渴，有防病治病等功效，民间称为“甜茶”、“神茶”。 青钱柳叶作为一种具有甘润兼清热特质的资源，其降血糖作用已引起许多学者的关注[8-9]。现代研究表明，青钱柳叶可以降低模型小鼠空腹血糖，保护胰岛细胞的作用；也有降低2型糖尿病患者血糖的作用，而对正常人血糖无影响，未见明显毒副作用[10]。石斛性微寒，味甘、淡，滋阴清热，养胃生津，因其养阴清热润燥的功能自古以来就是治疗消渴症的专药[11]。研究表明，铁皮石斛提取物能有效降低模型小鼠的空腹血糖，改善异常糖耐量，较好地控制2型糖尿病小鼠的血糖水平，增加受体对胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗，提高组织器官对葡萄糖的摄取和利用发挥降糖作用[12]。桑白皮味甘，性寒，归肺经，有泻肺平喘、利水消肿的功效，《本草纲目》中有记主治消渴尿多。有研究报道，桑白皮总黄酮具有降低2型糖尿病大鼠的血糖和甘油三酯的作用[13]。简而言之，QQL组方中所含药材均具有滋阴、清热、生津的功效，又可降低血糖，构成了其改善2型糖尿病的物质基础。

现代医学认为，糖尿病是一种以高血糖症为主要表现的综合代谢紊乱疾病。其中2型糖尿病的主要特点是胰岛素抵抗及相关的胰岛素缺陷。胰岛素抵抗在2型糖尿病发生、发展中起重要作用，改善胰岛素抵抗是治疗2型糖尿病的重要策略[14]。本实验研究旨在通过现代研究观察QQL组方对2型糖尿病大鼠的治疗作用。实验采用STZ联合高脂饮食建立的2型糖尿病大鼠：先以高脂饲料喂养大鼠1个月，诱发其胰岛素抵抗症状，再给予低剂量STZ。此模型具有中度高血糖、胰岛素抵抗和成功率高等特点，且此模型缩短了造模的时间，病理改变也符合人类2型糖尿病的特点，故多用于评价治疗2型糖尿病药物的效果[15]。实验显示给药前造模动物体重明显减轻，血糖显著升高，胰岛素水平下降，糖化血红蛋白含量明显升高，血糖曲线下面积明显下降，胰岛结构损伤，界限不清晰，胰岛细胞中胞浆减少，基本符合2型糖尿病患者的特点，与文献报道一致[16]。

糖尿病主要表现为高血糖，控制血糖水平是控制糖尿病及其并发症的重要手段。连续给予QQL组方6周后血糖检测结果显示，与模型对照组相比，中、高剂量组的大鼠从 4周开始血糖水平有明显的下降，6周血糖水平有进一步降低的趋势，提示此段时间内该组方对II型糖尿病大鼠血糖有较好的控制作用。但由于血糖水平易受到应激、进食、身体状况等因素的影响[17]，所以我们进一步检测了血清糖化血红蛋白指标。糖化血红蛋白是血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，结合生成的糖化血红蛋白是不可逆的反应，与血糖浓度成正比，且保持120 d左右，因此糖化血红蛋白水平反映的是在检测前120 d内的平均血糖水平[18]。6周后血清糖化血红蛋白结果显示，QQL组方中、高剂量组2型糖尿病大鼠的糖化血红蛋白显著降低，进一步说明QQL组方对2型糖尿病大鼠血糖的长期控制有较好的作用。本实验结果显示，与模型对照组相比，QQL组方治疗2型糖尿病大鼠6周，中、高剂量组大鼠的糖化血红蛋白显著降低、各时点血糖曲线下面积均明显减少、胰岛形态有所改善、胰岛细胞内胞浆增加、空泡变性减少，进一步说明QQL组方对2型糖尿病大鼠血糖的长期控制有较好的疗效，提示该组方对2型糖尿病大鼠的胰岛受损情况有一定改善作用。

研究发现，高血糖和高游离脂肪酸可通过PKC途径激活细胞内NADPH，生成大量活性氧簇[19]，且胰岛β细胞对活性氧和活性氮敏感，抗氧化物质的酶活性较一般细胞低，易受到氧化损伤并凋亡[20]；胰岛β细胞在氧化应激下分泌IL-1β和TNF-α等炎症因子，引起炎症反应加重胰岛细胞损伤，使胰岛素分泌减少[21-22]。有研究显示，氧化应激是引起胰岛素抵抗的重要因素，主要通过激发细胞内炎症信号传导途径和c-Jun 氨基末端激酶通路，干扰胰岛素与胰岛素受体结合后的信号传导，减弱胰岛素生理作用，从而导致胰岛素抵抗[23-24]。现代研究表明，本组方中青钱柳、桑白皮、石斛和陈皮具有较好抗氧化、抗炎作用。综合氧化应激与2糖尿病的相关性和本组方药物的作用特点，我们考察了抗氧化和抗炎相关指标，探讨本组方降血糖和胰岛保护作用的初步机制。实验结果显示，QQL组方中、高剂量组显著降低MDA含量，升高GSH水平，高剂量组SOD水平也有显著升高，对糖尿病大鼠的氧化应激状态有较明显的改善，其作用与药效结果趋势较一致，考虑本组方的降糖作用可能与抗氧化作用有关。另外，高剂量组IL-β和TNF-α水平也较模型组显著降低，提示组方对糖尿病大鼠的炎症状态也有一定的改善作用。

综上所述，QQL组方可以显著降低2型糖尿病大鼠的血糖和糖化血红蛋白，升高胰岛素水平，对胰岛细胞有保护作用，改善了胰岛细胞的功能，增加机体对胰岛素的敏感性，其机制可能与抗氧化、抗炎相关。而且该组方合理，提示其对2型糖尿病的辅助治疗有较好的应用前景。但由于本实验的局限性，QQL组方与其他中药组方治疗效果对比及本组方对2型糖尿病大鼠治疗的具体作用机制还有待进一步深入研究。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

TherapeuticeffectofQQLprescriptionontype2diabeticrats

JIANG Xin-mei1, LIN Qiu-xiong2, HE Guo-dong2, HOU Xing-hua2, SHAN Zhi-xin2, DU Yao-min3

(1DepartmentofObstetrics&Gynecology,People’sHospitalofNanhaiEconomicDevelopmentZone,Foshan528222,China;2MedicalResearchCenter,3DepartmentofInternalMedicine,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail: 13005176016@163.com)

AIM: To investigate the therapeutic effect of Qingqianliu (QQL) antidiabetic prescription， containingCyclocaryapaliurus， on type 2 diabetic rats.METHODSTen rats were randomly chosen as normal control group, and other rats were used to establish diabetic rat models by high-fat diet feeding plus streptocin intraperitoneal injection. Successfully modeling rats were randomly divided into high (300 mg·kg-1·d-1), medium (150 mg·kg-1·d-1) and low (75 mg·kg-1·d-1) doses of QQL treatment groups, and model control group (10 rats in each group). The rats

daily treatment for 6 weeks. Meanwhile, the therapeutic effect of QQL on these type 2 diabetic rats were evaluated via the body weight, the levels of serum glucose, insulin and glycosylated hemoglobin, the glucose tolerance, the pathological changes of pancreatic islands, antioxidative indexes and inflammaory factors.RESULTSCompared with model control group, the body weight, serum insulin, glucose tolerance, serum SOD and serum GSH were increased, the serum glucose, glycosylated hemoglobin, MDA, IL-1β and TNF-α were decreased, and the pathological changes of pancreatic islands were improved in type 2 diabetic rats with QQL treatment at high and low doses (P<0.05 orP<0.01).CONCLUSIONThe QQL reduces the blood glucose， improves the glucose tolerance, and attenuates the damage of pancreatic islands. Its me-chanism may be related to antioxidative and anti-inflammatory effects.

Cyclocaryapaliurus; Antidiabetics; Type 2 diabetes; Insulin

R285.5； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.010

1000- 4718(2017)10- 1794- 07

2017- 06- 02

2017- 08- 31

国家自然科学基金资助项目(No. 81270222)

▲并列第1作者

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通迅作者 Tel: 13005176016； E-mail: 13005176016@163.com