多巴胺通过mTOR-EAAT2通路影响星形胶质细胞谷氨酸摄取能力*

温芳芳， 徐 竹， 刘乐平， 杨建静， 丁赛丹

(温州医科大学附属第一医院，浙江省神经老化与疾病研究重点实验室， 浙江 温州 325000)

多巴胺通过mTOR-EAAT2通路影响星形胶质细胞谷氨酸摄取能力*

温芳芳， 徐 竹， 刘乐平， 杨建静， 丁赛丹△

(温州医科大学附属第一医院，浙江省神经老化与疾病研究重点实验室， 浙江 温州 325000)

目的研究多巴胺(dopamine，DA)对星形胶质细胞谷氨酸(glutamate，Glu)摄取能力的影响，以及DA通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-兴奋性氨基酸转运体2(EAAT2)信号通路对星形胶质细胞Glu摄取能力的影响。方法采用Amplex Red谷氨酸测定试剂盒检测经过干预的原代皮层星形胶质细胞对Glu摄取含量的变化，RT-qPCR、Western blot和免疫荧光染色等检测EAAT2和mTOR mRNA 和蛋白质相对表达量，mTOR拮抗剂雷帕霉素或mTOR兴奋剂MHY1485干预在DA中共培养的星形胶质细胞，检测mTOR和EAAT2的表达情况，以及培养上清液Glu的含量。结果DA干预的原代星形胶质细胞中mTOR表达下调，EAAT2表达下调，培养上清液Glu水平上升；雷帕霉素干预后，EAAT2表达下调，培养上清液中Glu的含量增加；MHY1485干预后，EAAT2表达上调，培养上清液中Glu的含量下降。结论DA通过与星形胶质细胞mTOR-EAAT2通路相互作用，减弱星形胶质细胞摄取Glu的能力，引起细胞外Glu蓄积，最终损伤星形胶质细胞的功能。

多巴胺； 谷氨酸； 星形胶质细胞

多巴胺(dopamine，DA)是α、β肾上腺素受体和多巴胺受体的激动剂。谷氨酸(glutamate，Glu)是大脑内主要的兴奋性神经递质，在学习和记忆上有着重要作用。Glu是哺乳动物的中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，但是过度刺激Glu受体反而会造成兴奋性中毒[1]。Glu中毒已知参与很多神经系统疾病包括阿尔茨海默症，缺血性脑卒，帕金森综合征，癫痫症和抑郁症[2-4]。

活化的星形胶质细胞既具有保护神经元的作用，又能分泌细胞毒因子、炎症因子和补体蛋白而损害神经元[5]。我们前期实验证实DA蓄积会诱导儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)抑制剂表达上调[6]。COMT是多巴胺(dopamine，DA)的降解酶，本课题组前期实验中采用DA干预，发现星形胶质细胞分泌TNF-α并导致神经元凋亡[7]，后又发现DA抑制神经元中学习记忆通路Glu-NO-cGMP的活性[8]，因此推测脑组织DA含量增加可能导致细胞外Glu累积。突触间隙的兴奋性氨基酸转运体2(excitatory amino acid transporter 2， EAAT2)能清除谷氨酸，哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)被报道可以调控Glu转运体表达[3]。Glu诱导的兴奋性中毒可能在DA干预的星形胶质细胞功能损伤中扮演着重要角色。本研究探索DA是否会减弱星形胶质细胞对Glu的摄取能力，阐明DA和信号通路协同损伤星形胶质细胞的分子机制。

材 料 和 方 法

1药物、仪器与试剂

微量渗析探针和微量泵购自BAS；mTOR拮抗剂雷帕霉素、mTOR兴奋剂MHY1485、辣根过氧化物酶、 L-谷氨酸氧化酶、 谷氨酸丙酮酸氧基转移酶、丙氨酸和6-羧基荧光素购自Sigma-Aldrich； Amplex Red谷氨酸测定试剂盒、RNA-Easy试剂盒、低聚糖(dT)、dNTP、 DTT、莫罗尼鼠白血病病毒逆转录酶、RNaseOUT和5×FS缓冲液购自Invitrogen；EAAT2和mTOR引物由Invitrogen合成。ABI-棱柱7700序列检测系统购自Applied Biosystems。iTaqTM超高速与ROX购自Bio-Rad。

2实验方法

2.1原代皮层星形胶质细胞(primary cortical astrocytes，PCAs)的分离和干预[9]取新生24 h内的SD乳鼠，大脑皮层组织用机械消化得到细胞悬液。细胞铺板在75 cm2的细胞培养瓶，将1.5×106个细胞培养在1 mL含1% 血清的DMEM/F12培养基中，培养72 h。之后，PCAs分别以每孔1.5×106培养在6孔培养板中。mTOR拮抗剂雷帕霉素(100 μmol/L)或mTOR兴奋剂MHY1485(10 μmol/L)与DA(最终浓度为10 μmol/L)共培养星形胶质细胞，对照加同样量的缓冲液，3个重复。

2.2细胞外Glu摄取含量检测 通过Amplex Red谷氨酸测定试剂盒检测经过干预后PCAs对Glu摄取含量的变化。在DA(10 μmol/L)干预PCAs 12 h之后，由含500 μmol/L谷氨酸的HEPES缓冲液替代，在每隔相同时间，取50 μL上清液转入96孔板中，接着与50 μL混合物(100 mmol/L Amplex Red，250 U/L辣根过氧化物酶，80 U/L L-谷氨酸氧化酶，500 U/L谷氨酸丙酮酸氧基转移酶和200 μL丙氨酸)混合后，37℃温浴 30 min。酶标仪在波长为530 nm处(对比参考波长为590 nm)测定吸光度。谷氨酸含量代入谷氨酸标准曲线计算得到。

2.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验 用RNA-Easy试剂盒提取总RNA。采用相对定量法定量靶基因，以 β-actin 为内参照，计算待测EAAT2和mTOR mRNA 相对表达量。引物序列：EAAT2的上游引物为5′-ATGCTCCTCATTCTCACAG-3′，下游引物为5′-CTACATTGACCGAAGTTCTC-3′；mTOR的上游引物为5’-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3’，下游引物为5’-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3’；β-actin的上游引物为5′-GCTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′ ，下游引物为5′-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGTGG-3′。qPCR用ABI-棱柱7700序列系统检测，mRNA水平采用2-ΔΔCt法计算。

2.4Western blot分析 原代星形胶质细胞裂解，匀浆，离心后取上清液进行蛋白变性，以15% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜，5% 脱脂奶粉封闭1 h，加EAAT2、mTOR和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜，用TBST充分洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记 II 抗37 ℃孵育1 h，TBST 充分洗涤，ECL 发光显影；用CIS 凝胶图像处理系统进行分析。

3统计学处理

应用SPSS 16.0统计分析软件，研究结果以均数±标准差(mean±SD)表示，计量资料用完全随机设计单因素方差分析(one-way ANOVA)；计数资料用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1DA对星形胶质细胞EAAT2表达的影响

RT-qPCR的结果显示DA干预的PCAs中EAAT2的mRNA水平显著减少，并且呈时间依赖性；Western blot实验结果显示，DA干预的PCAs中EAAT2蛋白表达水平也随时间逐渐减少，见图1。

Figure 1. The change of EAAT2 mRNA (A) and protein (B) expression in the PCAs after treatment with DA. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h.

图1DA干预PCAs后EAAT2的mRNA和蛋白表达水平的变化

2DA对星形胶质细胞mTOR表达的影响

RT-qPCR的结果显示，DA干预的PCAs中mTOR的mRNA水平显著减少，并且呈时间依赖性；Western blot实验结果与mRNA结果趋势一致，mTOR蛋白表达水平显著减少，并且呈时间依赖性，见图2。

Figure 2. The change of mTOR mRNA (A) and protein (B) expression in the PCAs after treatment with DA. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h.

图2DA干预PCAs后mTOR的mRNA和蛋白表达水平的变化

3DA对mTOR抑制/激活后的PCAsEAAT2表达的影响

mTOR拮抗剂雷帕霉素与DA干预的PCAs共培养后的RT-qPCR和Western blot实验分析结果显示，EAAT2的mRNA水平和蛋白表达都显著降低；mTOR激活剂MHY1485与DA干预的PCAs共培养后，EAAT2的mRNA水平和蛋白表达显著上升，见图3。

Figure 3. The change of EAAT2 mRNA (A) and protein (B) expression in the PCAs after treatment with rapamycin/MHY1485 and DA. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDA alone.

图3雷帕霉素/MHY1485与DA干预PCAs后EAAT2的mRNA和蛋白表达水平的变化

4DA对mTOR抑制/激活后的PCAs对Glu摄取能力的影响

如图4所示，雷帕霉素与DA干预的PCAs共培养后，细胞外的Glu水平显著上升。MHY1485与DA干预的PCAs共培养后，其细胞外的Glu含量显著下降。

Figure 4. The Glu content in the culture supernatant of the PCAs after treated with rapamycin/MHY1485 and DA. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDA alone.

图4雷帕霉素/MHY1485与DA干预PCAs后上清液Glu含量的比较

讨 论

谷氨酸是大脑主要的兴奋性神经递质，过多的Glu蓄积在细胞间隙会引起神经兴奋性中毒而受损，将会引发多种神经退行性疾病。星形胶质细胞能够通过突触间隙的EAAT2清除排到细胞外大约90%的谷氨酸[10]。已有报道星形胶质细胞mTOR分子水平的改变与星形胶质细胞EAAT2表达水平和功能相关[11]。

维持Glu内稳态的主要通路是通过EAAT1和EAAT2再摄取[12]，Glu释放入突触间隙后，在神经元活动期间需要通过兴奋性氨基酸转运体快速摄取，EAAT1和EAAT2会优先清除位于星形胶质细胞外大部分的Glu[12]。这些转运体在控制兴奋信号和阻止细胞外Glu兴奋毒性聚集方面起着至关重要的作用[12-13]，所以EAAT1和EAAT2的失活可能会导致Glu异常的累积，从而损伤星形胶质细胞。已有报道表明，EAAT2的长期损伤会促进中枢神经系统功能紊乱[14]。非选择性的EAATs抑制剂会诱导EAAT2功能紊乱，明显影响行为反应[15]和诱发神经退行性病变[16]。在我们的实验结果中，EAAT2的mRNA和蛋白质表达因DA干扰显著降低，与Danbolt等[12]所报道的EAAT2蛋白表达降低后干扰Glu的清除相符。我们的实验结果显示Glu的清除能力会因DA干扰减弱。基于大脑释放增加的DA会导致大脑兴奋性氨基酸转运异常的现象，我们观测到DA干预星形胶质细胞对Glu摄取的最明显改变是EAAT2的翻译和转运功能下降，从而降低对Glu摄取能力。前期实验中我们已经发现DA通过诱导星形胶质细胞中NADPH氧化酶活化产生活性氧，导致蛋白质酪氨酸酸化，改变星形胶质细胞功能[17]。

DA干预下的星形胶质细胞mTOR表达降低[18]；mTOR可以调控Glu转运体在星形胶质细胞的表达[18]，mTOR可能涉及DA介导的EAAT2的下调。DA干预星形胶质细胞后协同mTOR下调EAAT2，从而降低Glu清除能力而导致Glu水平增加。已知雷帕霉素为mTOR竞争者，能够调节Glu的清除能力[11]。因此mTOR在DA诱导的过量Glu的释放中有着重要的作用。DA可以降低星形胶质细胞mTOR的表达，这会造成mTOR/EAAT2受损及伴随着Glu清除的受阻。

综上所述，本次我们阐明DA是通过mTOR-EAAT2这一信号通路影响Glu的摄取从而诱导Glu的蓄积，Glu在细胞间隙聚集会引起神经兴奋毒性，从而使星形胶质细胞受损，这涉及很多的神经退行性疾病[19-20]。我们的实验研究DA体外干预星形胶质细胞，明确DA抑制星形胶质细胞对Glu的摄取，引起胶质细胞兴奋中毒，且星形胶质细胞作为中枢神经系统中含量最丰富的细胞在阿尔茨海默症的发病过程中起十分重要的作用[21]，可以更好地确定DA对脑内谷氨酸摄取能力的影响及相关疾病的发病机制。

鉴于星形胶质细胞在多种神经退行性疾病中的作用越来越受到重视，后续我们还需要进一步了解DA体内干预大鼠海马组织的星形胶质细胞的具体机制，将有助于改善和治疗神经退行性疾病。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effectofdopamineonglutamate-uptakeabilityofastrocytesbyregulatingmTOR-EAAT2pathway

WEN Fang-fang, XU Zhu, LIU Le-ping, YANG Jan-jing, DING Sai-dan

(ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofAgingandNeurologicalDiseaseResearch,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:firstdsdan@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of dopamine (DA) on the glutamate (Glu)-uptake ability of astrocytes, and the role of mammalian target of rapamycin (mTOR)-excitatory amino acid transporter 2(EAAT2) pathway in this process.METHODSExtracellular Glu levels in DA-treated primary cortical astrocytes (PCAs) were measured by a fluorimetric method. The relative expression of EAAT2 and mTOR at mRNA and protein levels was measured by RT-qPCR and Western blot. PCAs stimulated with or without DA in the presence or absence of mTOR antagonist rapamycin or mTOR agonist MHY1485 were used to determine the expression of mTOR and EAAT2, and Glu content in the culture supernatant was also measured.RESULTSThe expression of mTOR in DA-treated PCAs was decreased, the expression of EAAT2 was also decreased. Extracellular Glu levels of DA-treated PCAs were elevated significantly. When the PCAs were stimulated with DA in the presence of rapamycin, the expression of EAAT2 was decreased, and the levels of extracellular Glu was significantly increased. In the presence of MHY1485, the expression of EAAT2 was elevated, and significant decrease in the levels of extracellular Glu was also observed.CONCLUSIONDA interacts with mTOR-EAAT2 pathway to reduce the Glu-uptake ability of the astrocytes, and causes extracellular Glu accumulation, ultimately destroys the function of astrocytes.

Dopamine; Glutamate; Astrocytes

R741； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.003

1000- 4718(2017)10- 1746- 05

2017- 01- 22

2017- 03- 27

国家自然科学基金资助项目(No. 81671042； No. 81300308)

△通讯作者 Tel: 15888209333; E-mail: firstdsdan@hotmail.com

杂志网址： http://www.cjpp.net