钙离子感受蛋白STIM1与Orai1在钙敏感受体介导钙内流及NO生成中的相互作用*

王腊梅， 钟 华， 唐 娜， 庞丽娟， 张春军， 何 芳△

(石河子大学医学院 1新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室， 2病理生理教研室， 3病理教研室， 新疆 石河子 832002)

钙离子感受蛋白STIM1与Orai1在钙敏感受体介导钙内流及NO生成中的相互作用*

王腊梅1, 2， 钟 华1, 2， 唐 娜1, 2， 庞丽娟1, 3， 张春军1, 2， 何 芳1, 2△

(石河子大学医学院1新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，2病理生理教研室，3病理教研室， 新疆 石河子 832002)

目的研究Ca2+感受蛋白[基质相互作用分子1(STIM1)与钙释放激活钙通道蛋白1(Orai1)]在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙敏感受体(CaSR)介导的钙内流和一氧化氮(NO)生成中的相互作用。方法将CaSR激动剂精胺[钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)均激活]单用或与ROC模拟剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)+CaSR负性变构调节剂Calhex 231(激活ROC、阻断SOC)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro 31-8220和PKCα/β1选择性抑制剂Go 6976(激活SOC、阻断ROC)联合孵育HUVECs；利用免疫荧光技术检测HUVECs中STIM1和Orai1的蛋白表达和共定位；免疫共沉淀法检测STIM1和Orai1之间的相互作用；取2～3代HUVECs随机分为特异性的质粒转染组(shSTIM1+shOrai1组)、空质粒组(vehicle-STIM1+vehicle-Orai1组)和未转染组(control组)，将3组细胞分别加入上述4组不同药物刺激，采用荧光探针Fura-2/AM检测HUVECs中Ca2+浓度的变化，NO荧光探针DAF-FM DA负载方法同步检测HUVECs中NO生成的变化。结果STIM1和Orai1蛋白表达共定位于胞浆，与control组相比，加入Calhex 231+TPA、Ro 31-8220和Go 6976刺激后，STIM1和Orai1在胞浆中的定位均减少，且二者的相互作用均减弱；在4种不同处理因素作用下，shSTIM1+shOrai1组细胞内Ca2+浓度和NO净荧光强度均明显降低(P<0.05)。结论STIM1与Orai1以二元复合物的形式共同调节CaSR，并通过激活SOC和ROC介导钙内流及NO生成。

基质相互作用分子1； 钙释放激活钙通道蛋白1； 钙敏感受体； 一氧化氮

钙离子(calcium ion，Ca2+)是细胞内重要的信号分子，钙库的排空可以激活胞外Ca2+的内流，这种钙内流的方式被称作钙池操纵性钙内流(store-operated calcium entry，SOCE)，在传递细胞信息方面非常重要。血管内皮细胞持续Ca2+内流可释放舒张因子如一氧化氮(nitric oxide，NO)以维持血管内环境稳定。血管内皮功能障碍是多种心血管疾病的共同病理机制。在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中，精胺(spermine)可通过激活钙敏感受体(Ca2+-sensing receptor，CaSR)而引起细胞内钙离子浓度(intracellular Ca2+concentration，[Ca2+]i)升高及NO的生成。

在生理条件下，钙池操纵性钙通道(store-operated calcium calcium channels，SOC)和受体操纵性钙通道(receptor-operated channels，ROC)作为非兴奋细胞介导的胞外Ca2+内流的主要途径，两者以协同的方式参与了CaSR激活，进而引发持续Ca2+内流和NO生成[1-2]。本课题组近期的研究逐步揭示了SOCE的分子机制，确定了瞬时受体电位通道1(transient receptor potential channel 1，TRPC1)、基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)和钙释放激活钙通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1，Orai1)均为参与CaSR经SOC和ROC介导的Ca2+内流和NO生成过程中的关键分子组件，以SOCE复合体的形式对疾病的发生发展产生作用[3]。亦有研究表明组成SOC亚基的Orai1、TRPC1和STIM1关键分子组件和相互作用模式在不同细胞类型有所不同。如在Jurkat细胞Orai1是构成SOC必需的分子组件，敲低TRPC1或TRPC3则不影响SOC和ROC。本研究拟在前期工作的基础上，试图阐明STIM1与Orai1在钙敏感受体介导Ca2+内流和NO生成中的相互作用模式，有助于学者以介导钙活动相关机制为靶点进行药物筛选，并为心血管疾病防治提供新思路。

材 料 和 方 法

1实验材料

健康孕妇剖宫产的新鲜脐带来自华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科(性别和体重不限)，该实验经伦理委员会批准和个人知情同意。

2主要试剂

内皮细胞培养基(Sciencell)；蛋白酶抑制剂(Calbichem)；G418(Biosharp)；去内毒素高纯度质粒抽提试剂盒(Omega)；LipofectamineTM2000、Fura-2/AM与Opti-MEM(Invitrogen)；shRNA(上海吉凯基因化学技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒和DAF-FM DA(NO荧光探针)(Beyotime)；ECL发光试剂盒(ThermoBiosharp)；鼠抗人STIM1单克隆抗体和鼠抗人Orai1多克隆抗体(Abcam)；鼠抗β-actin单克隆抗体(Santa Cruze)；II 抗(Protein Tech)；其余均为国产分析纯试剂。

3主要仪器

CX-102型超净工作台(安徽蚌埠净化设备厂)；二氧化碳培养箱(Thermo)；Ca2+成像系统FV300、倒置荧光显微镜IX-70和激光共聚焦显微镜FV300(Olympus)。

4方法

4.1HUVECs的培养 依据参考文献的方法[4-5]培养HUVECs，在无菌条件下取健康孕产妇剖宫产胎儿的新鲜脐带。采用胰酶消化法用含10%胎牛血清的ECM培养基(添加100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素混合液)原代培养HUVECs，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，待细胞生长至90%融合时进行常规传代。

重组质粒由实验室前期构建，基因转染步骤参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行。结合文献[6]的方法，取对数生长期的HUVECs接种于6孔板(取2个6孔板铺板)，待细胞融合至85%时，将STIM1 shRNA与Orai1 shRNA联合转染至HUVECs中。实验中1～3孔为转染STIM1 shRNA和Orai1 shRNA的HUVECs，即实验组(shSTIM1+shOrai1组);4～6孔为空质粒组(vehicle-STIM1+vehicle-Orai1组);7～9孔为未做任何转染处理的细胞，即空白对照组(control组)。分别在转染后的24 h、48 h和72 h于荧光显微镜下观察GFP荧光。同时采用G418进行逐步筛选获得稳定克隆。

4.2免疫荧光技术检测HUVECs中STIM1与Orai1的蛋白表达 取于玻片上生长24 h 的HUVECs，PBS溶液冲洗细胞，冰甲醇固定20 min后，0.5% Triton-PBS透化10～15 min，封闭后轻甩去封闭液，滴加相应 I 抗混合液，4 ℃孵育(选用湿盒保持玻片湿度)。次日洗片后滴加对应荧光标记的 II 抗混合液(1∶100稀释)，室温避光孵育1 h。洗片，1 mg/L DAPI 室温避光孵育15 min复染细胞核。洗片，滴加防淬灭剂后于荧光显微镜下观察STIM1与Orai1的蛋白表达情况。阴性对照组以PBS代替相应 I 抗孵育，镜下观察并记录结果。

4.3免疫共沉淀法检测HUVECs中STIM1与Orai1的相互作用 (1)STIM1多克隆抗体沉淀(正向)：将2～3代HUVECs接种于放有圆形玻片的培养皿中，待细胞达85%融合，与药物孵育20 min，加入裂解液充分裂解后，12 000×g离心 3～5 min，取上清，加入 I 抗，4 ℃摇床过夜，按1∶10体积比加 50%的 Protein G Agarose，4 ℃ 摇床上混匀10 min后，1 000 r/min，4 ℃离心15 min，吸除上清液，不能吸掉的Protein G Agarose 用裂解液(500 μL)洗涤沉淀5次，洗涤时离心条件和吸除上清液要求同上。完成最后1次洗涤后去上清，加入SDS蛋白上样缓冲液中，混匀煮沸5 min， 200×g离心 3 min ，取上清进行SDS-PAGE，用Orai1作为I抗(1∶1 000)进行Western blot分析。(2)Orai1单克隆抗体沉淀(反向)：用STIM1作为I抗(1∶1 000)进行Western blot分析，方法同(1)。实验中用非特异性鼠IgG代替 I 抗沉淀作为对照。

4.4HUVECs中Ca2+浓度的荧光测定 首先将联合转染的HUVECs接种于放有圆形玻片的小培养皿中，待细胞融合至85%以上后，分别加入CaSR激动剂精胺及ROC模拟剂(TPA)+CaSR负性变构调节剂Calhex 231、PKC抑制剂Ro 31-8220与PKCα/β1选择性抑制剂Go 6976。联合转染48 h后将Fura-2/AM与含钙液以1∶499的比例混合后加入，37 ℃孵育细胞后并去酯化处理[6]。激光共聚焦监测荧光的动态变化,分析得出两激发光的荧光强度比值的变化 (即Δratio)以反映[Ca2+]i。

4.5HUVECs中NO浓度的荧光测定 HUVECs处理同4.4。联合转染48 h后按1∶2 000比例加入DAF-FM DA荧光探针稀释液，37 ℃孵育细胞后室温避光条件下，在细胞层面实时检测刺激前后荧光的强弱[6]，并通过Ingenuity Pathway Analysis软件进行分析。

5统计学处理

所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。实验数据用均数±标准误(mean±SEM)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组均数间的两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1免疫荧光技术观察HUVECs中STIM1与Orai1的蛋白表达

在激光共聚焦显微镜下胞核的DNA染料(DAPI)阳性着色显示为蓝色荧光，STIM1的阳性着色为红色荧光，Orai1的阳性着色为绿色荧光，橙黄色荧光则代表红色和绿色荧光的叠加荧光。结果可见正常对照组HUVECs中STIM1和 Orai1蛋白的表达呈阳性，两者共定位于胞浆，HUVECs分别经Calhex 231+TPA+精胺+Ca2+、Ro 31-8220+精胺+Ca2+和Go 6976+精胺+Ca2+刺激后镜下的荧光示STIM1和Orai1在胞浆中的定位均减少，两者的结合也明显减少，见图1。

2免疫共沉淀法检测HUVECs中STIM1与Orai1的相互作用

各处理组正向STIM1/Orai1或反向Orai1/STIM1分别与静息状态下的正向STIM1/Orai1或反向Orai1/ STIM1的相对比值的百分数表示STIM1和Orai1相互作用的强弱。与control组和spermine+Ca2+组比较，Calhex 231+TPA+spermine+Ca2+组、Ro 31-8220+spermine+Ca2+组和Go 6976+spermine+Ca2+组中STIM1和Orai1的相互作用减弱(P<0.05)，见图2。

3不同处理因素对联合转染后HUVECs中[Ca2+]i和NO的生成的影响

3.1联合转染STIM1与Orai1使精胺诱导的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成减少 采用脂质体法将shSTIM1与shOrai1同时转染HUVECs，48 h后用G418进行稳筛，加入精胺处理细胞，与对照组(control组，即精胺+Ca2+组)及空质粒组(精胺+Ca2++vehicle-STIM1+vehicle-Orai1组)相比，实验组(精胺+Ca2++shSTIM1+shOrai1组)的[Ca2+]iΔratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05)。同时沉默STIM1与Orai1基因，能够使CaSR经SOC和ROC介导的[Ca2+]i和NO生成减少，见图3。

3.2联合转染STIM1与Orai1使TPA+Calhex231诱导的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成减少 同3.1的方法加入TPA+Calhex231处理细胞，与对照组(Calhex 231+TPA+精胺+Ca2+组)及空质粒组(Calhex 231+TPA+精胺+Ca2++vehicle-STIM1+vehicle-Orai1组)相比，实验组(Calhex 231+TPA+精胺+Ca2++shSTIM1+shOrai1组)中[Ca2+]iΔratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05)。这说明同时沉默STIM1与Orai1基因能够使CaSR经ROC介导的[Ca2+]i和NO生成减少，见图4。

Figure 1. The protein expression of STIM1 and Orai1 in HUVECs were detected by immunocytochemical. A1～A4: protein expression and immunofluoresence of Orail1 and STIM1 for nuclear in HUVECs stimulated by spermine； B1～B4， C1～C4 and D1～D4： protein expression and immunofluoresence of Orail1 and STIM1 stimulated by Calhex 231+TPA+spermine， Ro 31-8220+spermine and Go 6976+spermine， respectively； E1： blank control group； E2： negative control group (×60).

图1免疫荧光检测HUVECs中STIM1与Orai1的蛋白表达

3.3联合转染STIM1与Orai1使Ro 31-8220介导的的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成减少 同3.1的方法加入PKC抑制剂Ro 31-8220处理细胞，与对照组(Ro 31-8220+精胺+ Ca2+组)及空质粒组(Ro 31-8220+精胺+Ca2++vehicle-STIM1+vehicle-Orai1组)相比，实验组(Ro 31-8220+精胺+Ca2++shSTIM1+shOrai1组)中[Ca2+]iΔratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05)。这说明同时沉默STIM1与Orai1基因能够使CaSR经SOC介导的[Ca2+]i和NO生成减少，见图5。

Figure 2. The interaction between STIM1 and Orai1 examined by co-immunoprecipitation (Co-IP). A: positive Co-IP, Orai1 as a resistance； B: reverse Co-IP, STIM1 as a resistance； C: semi-quantity analysis of the interaction. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsspermine+Ca2+group.

图2免疫共沉淀法检测HUVECs中STIM1与Orai1的相互作用

Figure 3. The dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio (A～D) and NO fluorescence intensity (E～H) after spermine treatment in shSTIM1 and shOrai1 double transfected HUVECs. A and E: control group; B and F: vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group; C and G: shSTIM1+shOrai1 group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group.

图3精胺刺激HUVECs后STIM1与Orai1联合干扰组Ca2+和NO荧光强度的动态变化

Figure 4. The dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio (A～D) and NO fluorescence intensity (E～H) after Calhex 231+TPA treatment in shSTIM1 and shOrai1 double transfected HUVECs. A and E: control group; B and F: vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group; C and G: shSTIM1+shOrai1 group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group.

图4TPA+Calhex231刺激HUVECs后STIM1与Orai1联合转染组Ca2+和NO荧光强度的动态变化

Figure 5. Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio (A～D) and NO fluorescence intensity (E～H) after Ro 31-8220 treatment in shSTIM1 and shOrai1 double transfected HUVECs. A and E: control group; B and F: vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group; C and G: shSTIM1+shOrai1 group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group.

图5Ro31-8220刺激HUVECs后STIM1与Orai1联合转染组Ca2+和NO荧光强度的动态变化

3.4联合转染STIM1与Orai1使Go 6976作用的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成减少 同3.1的方法加入PKCα/β1抑制剂Go 6976处理细胞，与对照组(Go 6976+精胺+ Ca2+组)及空质粒组(Go 6976+精胺+Ca2++vehicle-STIM1+vehicle-Orai1组)相比，实验组(Go 6976+精胺+Ca2++shSTIM1+shOrai1组)中[Ca2+]iΔratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05)。这说明同时沉默STIM1与Orai1基因，能够使CaSR经SOC介导的[Ca2+]i和NO生成减少，见图6。

Figure 6. The dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio (A～D) and NO fluorescence intensity (E～H) after Go 6976 treatment in shSTIM1 and shOrai1 double transfected HUVECs. A and E: control group; B and F: vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group; C and G: shSTIM1+shOrai1 group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group.

图6Go6976刺激HUVECs后STIM1与Orai1联合转染中Ca2+和NO荧光强度的动态变化

讨 论

心脑血管疾病现已成为危害人类健康和致死的主要因素，其发病率呈现逐年上升的趋势。随着人们对STIMs与Orais生物学作用及机制深入研究，发现其在心脑血管疾病的发生发展中发挥重要作用。如STIM1和Orai1作为SOCE的调节蛋白存在于多种细胞中[7]，Voelkers等[8]首次证实STIM1和Orai1均表达于心肌细胞，并且是TG 耗竭Ca2+库后引发SOCE所必须的蛋白质，STIM1基因沉默后，可降低舒张期[Ca2+]i及咖啡因诱发的肌浆网中Ca2+释放。在内质网STIM1表达水平不变的情况下，当应用一些化学试剂使Orai1蛋白表达减少时，SOCE减弱且通过基因敲除技术分别敲除Orai1和STIM1基因，结果都会导致SOCE作用减弱，提示SOCE作用的减弱与Orai1和(或)STIM1蛋白表达水平降低有直接关系[9]。大量文献证实在不同细胞由TRPCs、STIMs和Orais三者之间形成的二元或三元复合物调节SOC或ROC介导的生理和病理生理功能。如在HEK293细胞株STIM1与Orai1在内质网膜与细胞膜的结合处激活SOC[10]，在肾小球膜细胞TRPC1和TRPC4共同组成SOC功能亚基，并通过STIM1/TRPC4相互作用介导SOC激活[11]，在血小板TRPC6与Orai1和STIM1相互作用激活SOC[12]。在大鼠主动脉血管平滑肌细胞研究证实血小板衍生生长因子依赖Orai1/STIM1-SOC介导了平滑肌细胞增殖和迁移[13]，STIM1/Orai1构成SOC过度激活参与了自发性高血压脑卒中大鼠主动脉血管明显的收缩[14]。TRPCs、肌浆/内质网钙ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)和微管末端结合蛋白1(microtubule end-binding protein 1，EB1)等参与了SOC介导的SOCE，它们与STIMs和Orais构成SOCE复合体[3]。Jardin等[15]在人血小板发现Orai1在介导TRPC1-STIM1相互作用及TRPC1形成钙通道的激活模式(依赖SOC或ROC)中发挥重要作用。

课题组前期实验研究表明，在HUVECs中CaSR在介导Ca2+内流、eNOS活性和NO生成中起着重要作用[2]。Ziegelstein等[4]在人的主动脉血管内皮细胞中证实，在CaSR激动剂精胺的刺激下，通过三磷酸肌醇和ryanodine受体敏感的钙池释放，可引起[Ca2+]i增加和NO生成，结果提示在此过程中可能有外钙内流的参与，且外钙内流涉及的钙通道相关蛋白STIM1、Orai1作为其关键分子组件参与了CaSR激活引发持续Ca2+内流和NO生成等相关心血管疾病的发生、发展。然而STIM1与Orai1二者之间相互作用模式以及功能尚未阐明，因此在这一领域的研究工作也显得尤为重要。本实验经免疫荧光技术、免疫共沉淀技术检测发现在HUVECs中，STIM1与Orai1共定位于胞浆，经Calhex 231+ TPA +精胺+Ca2+、Ro 31-8220+精胺+Ca2+、Go 6976+精胺+Ca2+刺激后，镜下荧光显示STIM1与Orai1在胞浆中的定位均减少且相互作用减弱。为了阐明STIM1与Orai1在HUVECs中CaSR介导Ca2+内流及NO生成中的作用，实验将特异性的STIM1 shRNA与Orai1 shRNA联合转染HUVECs，保证沉默基因有效抑制相关表达的同时，用精胺与HUVECs孵育激活SOC和ROC通路，发现在HUVECs中沉默STIM1与Orai1可抑制SOC和ROC通路介导的[Ca2+]i升高和NO生成。随后分别用Calhex 231+TPA、Ro 31-8220和Go 6976处理细胞，在细胞外含Ca2+的情况下检测HUVECs中[Ca2+]i与NO生成的变化。实验结果表明Ca2+内流和NO的生成过程中有SOC和(或)ROC参与，且在HUVECs中同时沉默STIM1与Orai1后对[Ca2+]i和NO生成均有抑制作用。最终证明STIM1与Orai1以二元复合物的形式作为SOC和ROC关键组件调节了CaSR途径介导的钙内流和NO生成。

在血管系统中CaSR可通过增加[Ca2+]i调节NO的释放和钾通道激活，在调节血管张力及高血压等心血管疾病的发生发展中起着重要的作用，而上述研究又为深入认识血管系统中STIM1和Orai1调节CaSR功能的生理和病生理作用和机制提供了重要理论基础。未来的研究将更多阐明在心血管系统的不同细胞中STIM1和Orai1的功能、寡聚化模式及调节机制，了解不同细胞中SOC和ROC的结构与调节机制之间的细微差别，进而在分子水平实现对选择性靶向作用治疗临床心血管疾病的防治提供一个新的途径。

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(责任编辑： 林白霜， 宋延君)

InteractionbetweenSTIM1andOrai1incalcium-sensingreceptor-mediatedcalciuminfluxandnitricoxidegeneration

WANG La-mei1, 2, ZHONG Hua1, 2, TANG Na1, 2, PANG Li-juan1, 3, ZHANG Chun-jun1, 2, HE Fang1, 2

(1KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases,MinistryofEducation，2DepartmentofPathophysiology，3DepartmentofPhysiology,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China.E-mail:fangf2002shz@126.com)

AIM: To investigate the interaction of Ca2+-sensing proteins， stromal interaction molecule 1 (STIM1) and calcium release-activated calcium channel protein 1 (Orai1)， in Ca2+-sensing receptor (CaSR)-mediated extracellular Ca2+influx and production of nitric oxide (NO).METHODSHuman umbilical vein endothlial cells (HUVECs) were incubated with CaSR agonist spermine [activating store-operated calcium channels (SOC) and receptor-operated calcium channels (ROC)] alone or combined with CaSR negative allosteric modulator Calhex 231+ROC analogue TPA (activating ROC, blocking SOC), protein kinase C (PKC) inhibitor Ro 31-8220, or PKCα/β1 selective inhibitor Go 6976 (activate SOC, blocking ROC). The protein expression of STIM1 and Orai1 was determined by the method of immunofluorescence. The interaction between STIM1 and Orai1 was examined by co-immunoprecipitation. The second to third passages of HUVECs were divided into STIM1 and Orai1 short hairpin RNA group (shSTIM1+shOrai1 group), vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group and control group， and then incubated with the 4 different treatments above. The intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) was detected using the fluorescent Ca2+indicator Fura-2/AM. The production of NO was also determined by DAF-FM DA fluorescent probe.RESULTSThe protein expression of STIM1 and Orai1 was located in the cytoplasm. Compared with control group, the localization of STIM1 and Orai1 in the cytoplasm was reduced after the HUVECs were incubated with Calhex 231+TPA, Ro 31-8220 or Go 6976, and the interaction of STIM1 and Orai1 was decreased significantly. The [Ca2+]iand the net NO fluorescence intensity in shSTIM1+shOrai1 group were significantly reduced after the 4 different treatments (P<0.05).CONCLUSIONSTIM1 and Orai1 are components of SOC and ROC in store- and receptor-operated Ca2+entry and NO generation.

Stromal interaction molecule 1; Calcium release-activated calcium channel protein 1; Ca2+-sen-sing receptor; Nitric oxide

R363； R541

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.007

1000- 4718(2017)10- 1773- 08

2017- 03- 20

2017- 07- 18

国家自然科学基金资助项目(No. 31160239;No. 81160018)

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