18α-GA 激活Nrf2对成体神经干细胞的影响*

杨 娜， 赵云鹤， 黄菲菲， 刘琦玮， 陆 利△

(山西医科大学 1人体解剖学教研室， 2生物制药系， 山西 太原 030001)

18α-GA 激活Nrf2对成体神经干细胞的影响*

杨 娜1， 赵云鹤1， 黄菲菲1， 刘琦玮2， 陆 利1△

(山西医科大学1人体解剖学教研室，2生物制药系， 山西 太原 030001)

目的明确18α-甘草次酸(18α-GA)对核因子E2相关因子2(Nrf2)的激活作用，观察上调Nrf2对成体神经干细胞(aNSCs)增殖和分化能力的影响，探讨维持aNSCs活力的有效途径。方法体外培养新生、成年和老年小鼠的侧脑室室膜下区神经干细胞(NSCs)，观察随年龄增长NSCs中Nrf2的表达变化。以18α-GA作用aNSCs，用real-time PCR和Western blot实验比较18α-GA组与DMSO对照组aNSCs的Nrf2表达变化。构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的Nrf2-shRNA慢病毒载体(LV)感染aNSCs， 用real-time PCR和Western blot实验检测shRNA对Nrf2的沉默效率。将aNSCs按照干预条件不同分为DMSO组、18α-GA组、LV-GFP组和LV-Nrf2-shRNA组，运用BrdU掺入实验、Tuj1免疫荧光染色、CCK-8实验、Hoechst 33342/PI双染色和活性氧簇(ROS)水平测定等方法评价18α-GA是否通过激活Nrf2对aNSCs的增殖、分化、细胞活力、细胞凋亡以及氧化应激水平产生影响。结果随年龄增长，成年和老年小鼠aNSCs的Nrf2 mRNA表达水平较新生小鼠NSCs显著降低(P<0.01)，但aNSCs的ROS水平显著高于新生小鼠NSCs(P<0.05)。应用18α-GA后， aNSCs的Nrf2 mRNA与蛋白表达水平较DMSO组明显升高(P<0.01)， 并且aNSCs的BrdU阳性率也显著增加(P<0.01)。2 mg/L 18α-GA 作用后，aNSCs的Tuj1阳性率和细胞活力较DMSO组显著升高(P<0.05)，而凋亡率和ROS水平显著下降(P<0.05和P<0.01)。但是，敲减aNSCs的Nrf2并应用18α-GA干预后， LV-Nrf2-shRNA组BrdU阳性率、Tuj1阳性率以及细胞活力均较LV-GFP组显著下降(P<0.05)，ROS水平却显著上升(P<0.05)。结论18α-GA可能通过激活Nrf2提高aNSCs的抗氧化能力，促进aNSCs增殖和分化，维持aNSCs潜能。

18α-甘草次酸； 成体神经干细胞； 核因子E2相关因子2； 细胞增殖； 细胞分化； 小鼠

成体神经干细胞(adult neural stem cells，aNSCs)主要分布于成年哺乳动物侧脑室室膜下区(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回(dentate gyrus，DG)，有自我更新和分化能力，能够修复受损的神经组织。然而，随年龄增长，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖潜能和细胞活力逐步降低，其潜在的机制亟待阐明[1]。氧化应激是导致细胞与组织损伤的重要原因，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生过多或机体抗氧化能力减退使高活性氧自由基攻击蛋白质、脂肪和核酸，导致蛋白变性、DNA断裂，引起细胞凋亡[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是近年发现的细胞抵抗内、外环境氧化刺激的关键因子，它通过与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合上调抗氧化基因的表达，抵抗氧化应激[3]。那么，Nrf2在aNSCs功能维持中是否发挥重要作用，激活Nrf2是否有助于提高aNSCs活力？有文献报道18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid，18α-GA)可以促进Nrf2核转位，激活人胚胎成纤维细胞Nrf2表达[4]。为此，本研究拟运用18α-GA作为Nrf2的激活剂，探讨上调Nrf2表达水平对aNSCs的影响。

材 料 和 方 法

1动物

清洁级BALB/c小鼠，雌雄不限，由山西医科大学动物中心提供，动物质量合格证编号为SCXK(晋)2015-0001。

2主要试剂

DMEM/F12 (Basic/KnockOut)、TrypLE Express、Accutase细胞消化液、ITS、B27和FBS购自Gibco；木瓜蛋白酶(papain)购自Worthington；表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)购自BioEasy；兔抗Nrf2多克隆抗体购自Abcam；兔抗β-actin多克隆抗体、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自生工生物；鼠抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU)抗体和鼠抗Tuj1抗体购自ABclonal；Hoechst 33342/PI双染试剂盒、BrdU、Cy3标记山羊抗鼠 II 抗和DCFH-DA购自Sigma；辣根过氧化物酶偶联抗兔 II 抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；山羊血清封闭液购自博士德生物；DAPI 购自Roche；CCK-8试剂盒购自日本同仁；PCR试剂盒和反转录试剂盒购自TaKaRa；RIPA裂解液购自碧云天； BCA试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；细胞培养板购自Corning；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3主要方法

3.1体外培养不同年龄阶段小鼠的NSCs (1)新生NSCs的分离培养：新生鼠(postnatal day 0，P0)用75%乙醇充分消毒后断头处死，头颅用冰冷0.01 mol/L HBSS分离液充分冲洗。在颅顶做正中切口，逐步剪开头皮，剥除颅骨，取出大脑组织，再次用0.01 mol/L HBSS冲洗后剥离外层脑膜，用无菌尖镊快速分离SVZ组织，放入含有DMEM/F12的离心管中，剪碎组织并加入适量TrypLE Express，37 ℃水浴5 min。用等量DMEM/F12终止消化，500×g离心5 min，弃去上清，用1 000 μL NSCs增殖培养基[DMEM/F12 (KnockOut)，2% B27无血清添加剂，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF，1% ITS，2 mg/L 肝素，1%青链霉素]充分重悬细胞，将细胞接种于用培养基浸润的6 孔培养板中，37 ℃、5% CO2静置培养，隔3 d换液, 培养7 d至细胞成球。(2)aNSCs的分离培养：成年鼠(postnatal day 60，P60)和老年鼠(postnatal day 300，P300)断头处死，头颅置于75%乙醇中冲洗消毒。剪开头部皮肤与颅骨，分离脑组织，置于无菌培养皿中并用冰冷的0.01 mol/L HBSS分离液充分冲洗。将组织翻转至腹侧，在视交叉前1.5 mm处行冠状切，用无菌尖镊快速分离SVZ组织，收集组织放入含有DMEM/F12的离心管中。低速离心弃去上层收集液，用组织剪将组织剪碎呈匀浆状，加入消化液(0.02 g papain和30 mL TrypLE Express)37 ℃水浴10 min。用等体积DMEM/F12终止消化后，500×g离心5 min。将细胞用aNSCs增殖培养基[DMEM/F12 (Basic)，2% B27无血清添加剂，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF，1% ITS，2 mg/L 肝素，1%青链霉素]重悬后种入培养板中。隔 3 d换液，培养7 d至细胞成球。

3.218α-GA体外干预实验 在aNSCs增殖培养基中加入用DMSO配制不同浓度的 18α-GA，每天换液，持续作用7 d，随后进行real-time PCR、Western blot、CCK-8实验和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平测定。18α-GA连续作用于aNSCs 7 d后，用适量Accutase酶消化神经球，按照8×107/L将细胞接种于多聚鸟氨酸(poly-orinithin，50 mg/L)和层黏连蛋白(laminin，20 mg/L)包被的玻片上，用含18α-GA的增殖培养基继续作用12 h，观察待细胞贴壁后，一部分细胞进行BrdU 掺入实验和Hoechst 33342/PI双染实验；另一部分细胞更换为含2 mg/L 18α-GA的促分化培养基[DMEM/F12 (Basic)、1% FBS、2% B27和1%的青链霉素]继续作用3 d，进行Tuj1免疫荧光染色实验。

3.3慢病毒感染aNSCs 合成靶向鼠Nrf2基因的shRNA 通过基因重组技术将序列为5’-CCAAAGCUAGUAUAGCAAUAA-3’的片段连接到含U6启动子及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的慢病毒载体(lentiviral vector，LV)中，构建shRNA重组质粒，并包装Nrf2 shRNA慢病毒颗粒(LV-Nrf2-shRNA)及其对照病毒颗粒(LV-GFP)。aNSCs培养7 d成球后，用Accutase酶消化为单个细胞，加入含病毒颗粒的培养基(MOI=40)，作用24 h。感染72 h后，于倒置显微镜下观察GFP的表达情况，并收集部分细胞进行Real-time PCR和Western blot实验检测Nrf2的敲减效率。另一部分细胞加入含有2 mg/L 18α-GA 的培养基继续培养7 d，进行相关实验检测。

3.4Real-time PCR实验 采用 RNAiso Plus(TaKaRa)试剂提取细胞总RNA。运用分光光度法检测RNA质量和浓度。5×Prime Script®RT Master Mix试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用SYBR Green法，以反转录得到的cDNA(100 ng)为模板在ABI StepOneTMPlus仪器检测，反应体系与条件参照SYBR® Premix Ex TaqTM(TaKaRa)说明书。反应完毕后采用2-ΔΔCt法进行基因表达的相对定量分析。内参照GAPDH的上游引物为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；目的基因Nrf2的上游引物为5’- GAGCAAGTTTGGCAGGAGCTA-3’, 下游引物为5’-GCTGTCCATTTCTGTCAGTGTG-3’。

3.5Western blot实验 收集细胞，加入RIPA裂解液，多次吹打使细胞悬浮，超声粉碎细胞。高速离心15 min后提取蛋白质上清。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度并高温变性备用。取20 μg蛋白进行12% SDS-PAGE分离，电泳完毕后，取出凝胶进行湿转使蛋白质由凝胶转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭后以兔抗β-actin多克隆抗体(1∶1 000)和兔抗Nrf2多克隆抗体(1∶1 000)4 ℃孵育12 h。TBST漂洗3次，辣根过氧化物酶偶联抗兔Ⅱ抗(1∶4 000)室温孵育2 h，TBST缓冲液漂洗后ECL检测，暗室曝光显影。

3.6BrdU掺入实验 在培养基中加入10 μmol/L的BrdU，12 h之后用4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，加入2 mol/L HCl 37 ℃水浴10 min暴露抗原。10%山羊血清37 ℃封闭1 h，BrdU的 I 抗(1∶100)4 ℃孵育12 h，PBS漂洗3次，37 ℃孵育Cy3标记的 II 抗2 h，DAPI染色15 min，抗荧光淬灭剂封片。Olympus荧光显微镜拍照，ImageJ软件分析。

3.7免疫荧光染色实验 分化培养结束后，取出aNSCs贴附的盖玻片，用4%多聚甲醛室温固定15 min，10%山羊血清37 ℃封闭1 h，4 ℃孵育抗Tuj1的 I 抗(1∶200)12 h， PBS漂洗，37 ℃孵育Cy3标记的 II 抗2 h， DAPI染色15 min，抗荧光淬灭剂封片。 Olympus荧光显微镜拍照，ImageJ软件分析。

3.8CCK-8实验 收集aNSCs并将其消化为单个细胞，按照1×103/孔接种于96孔板，继续作用72 h，培养结束前4 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂。培养结束后于450 nm测定吸光度(A)值。

3.9Hoechst 33342/PI双染实验 在aNSCs增殖培养基中加入5 mg/L Hoechst 33342，置于37 ℃孵育20 min后弃染液，PBS漂洗3次，加入用PBS配制的10 mg/L 碘化丙啶染液，室温孵育10 min后弃去染液，PBS漂洗后立即用Olympus 荧光显微镜观察拍照，ImageJ 软件分析。

3.10ROS水平的测定 收集aNSCs，按照5×104/孔接种于96孔板。用PBS清洗细胞2遍后，加入无血清培养液稀释的10 μmol/L DCFH-DA，将96孔板置于37 ℃孵箱60 min。BioTek酶标仪检测激发光485 nm、发射光535 nm处的荧光强度。

4统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行分析，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，SNK-q检验进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1不同年龄小鼠NSCs的Nrf2表达变化

从P0、P60和P300小鼠的SVZ分离培养NSCs， real-time PCR 结果显示P60组和P300组Nrf2 mRNA的表达水平均较P0组明显下降(P<0.01)，提示成年和老年鼠aNSCs Nrf2的mRNA表达水平显著低于新生鼠的NSCs，见图1。

218α-GA上调体外培养aNSCs中Nrf2的表达水平

应用1 mg/L与2 mg/L的18α-GA作用于体外培养的aNSCs 7 d， real-time PCR检测结果显示Nrf2的mRNA表达水平均较DMSO组明显上升(P<0.01)，见图2A。Western blot实验结果也证明给予18α-GA后，Nrf2的蛋白表达水平明显升高(P<0.01)，提示应用18α-GA能够上调Nrf2的表达，见图2B。

Figure 1. The mRNA expression of Nrf2 in the NSCs isolated from P0, P60 and P300 mice. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsP0 group.

图1不同年龄小鼠NSCs的Nrf2mRNA表达水平

Figure 2. Nrf2 expression in the aNSCs was increased after treated with 18α-GA. A: quantification of mRNA expression level of Nrf2 was measured by real-time PCR; B: Western blot analysis for the protein level of Nrf2. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsDMSO group.

图218α-GA上调体外培养aNSCs中Nrf2的表达水平

3Nrf2shRNA慢病毒感染效率

慢病毒载体感染aNSCs 72 h后，于倒置显微镜下观察GFP的表达情况，计数结果显示感染率可达86.2%±2.6%，见图3A。real-time PCR实验结果显示LV-Nrf2-shRNA组Nrf2的mRNA表达水平较LV-GFP组明显下降(P<0.01)；Western blot实验结果同样显示LV-Nrf2-shRNA组Nrf2的蛋白表达水平较LV-GFP组显著降低(P<0.01)，提示运用LV-Nrf2-shRNA感染aNSCs可以有效敲低Nrf2的表达水平，见图3B、C。

418α-GA上调Nrf2可提高aNSCs的增殖能力

应用不同浓度的18α-GA作用于aNSCs，BrdU掺入实验观察18α-GA对aNSCs增殖能力的影响。结果显示，随18α-GA浓度增高，aNSCs的BrdU阳性率增加，0.8 mg/L组、1 mg/L组、2 mg/L组和5 mg/L组aNSCs的BrdU阳性率均较DMSO组显著升高(P<0.01)，提示应用18α-GA能够提高aNSCs的增殖能力，见图4A。Nrf2基因敲减后应用2 mg/L 18α-GA作用7 d，BrdU掺入实验结果显示LV-Nrf2-sh-RNA组aNSCs的BrdU阳性率较LV-GFP组显著下降(P<0.05)，提示18α-GA可能通过上调Nrf2提高aNSCs的增殖能力，见图4B。

Figure 3. The infection efficiency of LV in the aNSCs. A: the images of aNSCs transfected with LV for 72 h (×200); B: the mRNA expression of Nrf2 in the aNSCs was measured by real-time PCR; C: the protein level of Nrf2 was analyzed by Western blot. Mean±SD.n=4～5.**P<0.01vsLV-GFP group.

图3Nrf2shRNA慢病毒的感染效率

Figure 4. The effects of 18α-GA on the proliferation of aNSCsinvitro. A: the aNSCs were stained with antibody against BrdU (red), while the nuclei were counterstained with DAPI (blue) (×400)， and the quantitative analysis of BrdU positive cells in the aNSCs treated with 18α-GA or DMSO was shown； B： after treated with 18α-GA for 7 d, the proliferation of aNSCs in LV-Nrf2-shRNA group and LV-GFP group was measured (×400). Mean±SD.n=4～5.**P<0.01vsDMSO group；#P<0.05vsLV-GFP group.

图418α-GA上调Nrf2提高aNSCs的增殖能力

518α-GA上调Nrf2提高aNSCs向神经元分化的能力

应用2 mg/L 18α-GA作用于aNSCs，分化培养3 d，Tuj1免疫荧光染色结果显示18α-GA组阳性率为42.6%±3.8%，较DMSO组显著上升(P<0.05)。但是，敲减Nrf2后， LV-Nrf2-shRNA组的Tuj1阳性率下降至32.5%±3.2%，较LV-GFP组显著下降(P<0.05)，提示Nrf2在18α-GA促进aNSCs向神经元方向分化过程中发挥作用，见图5。

Figure 5. Activation of Nrf2 by 18α-GA promoted the neuronal differentiation of aNSCs. The percentage of Tuj1+cells was evaluated for identifying neuronal differentiation (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDMSO group;#P<0.05vsLV-GFP group.

图518α-GA上调Nrf2提高aNSCs向神经元分化的能力

618α-GA上调Nrf2提高aNSCs活力，减少细胞凋亡

应用2 mg/L 18α-GA作用于aNSCs，CCK-8实验结果显示，18α-GA组的A值较DMSO组明显增高(P<0.05); Hoechst 33342/PI双染实验结果显示，18α-GA组aNSCs的凋亡率为5.6%±0.4%，较DMSO组明显下降(P<0.05)，提示18α-GA可以提高aNSCs的细胞活力，降低细胞凋亡率。敲减Nrf2基因后，LV-Nrf2-shRNA组的细胞活力较LV-GFP组显著降低(P<0.05)，但两组凋亡率的差异无统计学显著性，见图6。

Figure 6. Activation of Nrf2 by 18α-GA affected the viability of aNSCs. A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B and C: a double-labeling assay for detecting apoptotic cells with PI (red) and Hoechst 33342 (blue) (×200). Mean±SD.n=3～4.*P<0.05vsDMSO group;#P<0.05vsLV-GFP group.

图618α-GA上调Nrf2对aNSCs活力的影响

718α-GA上调Nrf2对aNSCsROS水平的影响

ROS水平的检测结果表明，P60组小鼠aNSCs的ROS水平较P0组明显上升(P<0.05)，见图7A。应用2 mg/L的18α-GA作用于aNSCs，其ROS水平较DMSO组显著下降(P<0.01)，若敲减Nrf2基因，LV-Nrf2-shRNA组的ROS水平较LV-GFP组上升约0.2倍(P<0.05)，提示18α-GA可能通过激活Nrf2降低aNSCs ROS水平，见图7B。

Figure 7. Activation of Nrf2 by 18α-GA affected the ROS levels of aNSCs. A: the ROS level of aNSCs in P60 group was higher than that of newborn NSCs; B: after treated with 18α-GA at 2 mg/L, the ROS level of aNSCs was measured. Mean±SD.n=3.△P<0.05vsP0 group；**P<0.01vsDMSO group;#P<0.05vsLV-GFP group.

图718α-GA上调Nrf2对aNSCsROS水平的影响

讨 论

成年哺乳动物的NSCs主要存在于SVZ与DG，具有自我更新和多向分化潜能。当神经组织受到损伤时，NSCs可以分化为神经元或胶质细胞，促进神经系统的功能修复[5-6]。但是，有关文献报道NSCs的标志物神经巢蛋白中间微丝(nestin)在成年鼠的SVZ表达水平较新生鼠明显下降，并且成年之后NSCs增殖和分化能力逐月下降，神经发生功能障碍，导致难以修复和更新受损的神经组织[1, 7]。因此，维持成年体内NSCs库的稳定性，并在脑损伤时有效激活内源性aNSCs参与神经修复，将有望为预防和治疗神经退行性疾病提供新途径。已有研究发现DNA损伤、端粒长度减少、氧化应激以及错误折叠蛋白的产生与累积等可以导致细胞活力下降[8-9]。氧化应激是影响NSCs活力和引发神经系统疾病的重要因素，当细胞受到内外环境的刺激时，ROS产生超过细胞的抗氧化能力，机体氧化与抗氧化系统之间的平衡破坏从而导致氧化应激。我们研究发现NSCs的氧化应激水平随年龄增长逐渐增高。相关文献报道，诱导NSCs发生氧化应激会造成细胞活力下降和DNA损伤等，最终导致NSCs老化进而死亡[10]。因此，抵抗细胞内的氧化应激将是维持NSCs功能和活力的重要途径。

研究发现，Nrf2是内源性抗氧化防御系统的关键调节蛋白，在氧化应激条件下Nrf2 发生核转位，与ARE结合，发挥抗氧化的保护作用[3, 11]。脑内Nrf2的表达水平随年龄增长而显著下降，且ROS水平在成年之后显著上升，导致氧化应激反应失衡[12]。有关文献报道Nrf2基因敲除小鼠SVZ区NSCs的生存能力和增殖能力以及向神经元方向的分化能力降低，嗅觉精细辨别能力受到损害[13]。敲除离体培养NSCs的Nrf2基因，神经球的数量和体积显著下降。相反，通过慢病毒感染过表达Nrf2可以使神经祖细胞的增殖分化能力增强，抵抗Aβ1-42产生的损害[14]。进一步说明Nrf2与NSCs的活力密切相关，可以作为研究维持NSCs潜能的关键靶点。

18α-GA是甘草中最重要的生物活性化合物的五环三萜糖苷，在胃肠道被微生物分解吸收，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗衰老等作用。研究证明应用18α-GA治疗神经母细胞瘤，可使caspase-3蛋白表达水平增加，细胞固缩体形成，促使神经母瘤细胞发生凋亡，从而发挥抗肿瘤作用[15]。此外，Papaevgeniou等[16]发现18α-GA可以减少Aβ1-42对小鼠原代皮层神经元的损害，降低细胞死亡率。目前有研究表明，18α-GA可以上调人胚胎成纤维细胞和小鼠神经元Nrf2的表达水平，延长人成纤维细胞的寿命，降低小鼠神经元的ROS水平，并改变Keap1的构象，抑制Nrf2泛素化，促进Nrf2发生核转位[4, 17]。入核后的Nrf2可以与ARE结合，从而启动下游解毒酶及抗氧化蛋白基因的转录，提高细胞的抗氧化能力[18-19]。本研究发现18α-GA可以上调aNSCs的Nrf2表达水平，促进aNSCs的增殖分化，提高细胞活力，降低细胞氧化应激水平。但是，敲减Nrf2后，18α-GA对aNSCs的保护作用受到影响，提示18α-GA可能通过激活Nrf2上调aNSCs活力。因此，18α-GA作为一种甘草活性化合物，可以有效诱导激活Nrf2，并且操作简便安全易于推广，在细胞保护方面具有潜在的应用前景。

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(责任编辑： 林白霜， 宋延君)

ActivationofNrf2by18α-GAaffectsproliferationofadultneuralstemcells

YANG Na1, ZHAO Yun-he1, HUANG Fei-fei1, LIU Qi-wei2, LU Li1

(1DepartmentofAnatomy，2DepartmentofBiologicalPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:luli@sxmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) activation by 18α-glycyrrhetinic acid (18α-GA) on the proliferation and self-renewal of adult neural stem cells (aNSCs), and to explore an effective way of maintaining the viability of aNSCs.METHODSNSCs were dissociated from subventricular zone of the mice at postnatal days 0, 60, and 300. The expression levels of Nrf2 in the NSCs at various ages were compared. After treatment with 18α-GA, the expression of Nrf2 was examined by real-time PCR and Western blot. shRNA lentiviral vector (LV) carrying green fluorescent protein (GFP) gene was constructed to knock downNrf2 expression. The knockdown efficiency in the aNSCs was detected by real-time PCR and Western blot. Subsequently, the aNSCs were divided into DMSO group, 18α-GA group, LV-GFP group and LV-Nrf2-shRNA group. BrdU incorporation assay, Tuj1 staining, CCK-8 assay, Hoechst 33342/PI staining and detection of reactive oxygen species (ROS) were performed to analyze the proliferation, differentiation, viability, apoptosis and oxidative stress levels of the NSCs.RESULTSThe mRNA expression level of Nrf2 in adult and aged NSCs was significantly lower than that in newborn NSCs (P<0.01), while the ROS level of aNSCs was significantly higher (P<0.05). After treatment with 18α-GA, the expression level of Nrf2 in the aNSCs was significantly up-regulated as compared with DMSO group (P<0.01). Increased number of BrdU+and Tuj1+cells was observed in 18α-GA group， indicating that 18α-GA-treated cells had higher viability (P<0.05). Meanwhile, there were fewer apoptotic cells and lower ROS level in 18α-GA group than those in DMSO group (P<0.05). After knockdown ofNrf2 in aNSCs and then treated with 18α-GA, there were less BrdU+and Tuj1+cells, as well as the aNSCs with lower viability in LV-Nrf2-shRNA group (P<0.05). Moreover, the ROS level was increased in LV-Nrf2-shRNA group as compared with LV-GFP group (P<0.05).CONCLUSIONActivation of Nrf2 by 18α-GA elevates the antioxidant capacity of aNSCs， thus ameliorating the cell proliferation and differentiation potentials.

18α-glycyrrhetinic acid； Adult neural stem cells; Nuclear factor E2-related factor 2; Cell proli-feration; Cell differentiation; Mice

R741； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.002

1000- 4718(2017)10- 1738- 08

2017- 03- 30

2017- 07- 07

国家自然科学基金资助项目(No. 81571381)；山西省自然科学基金资助项目(No. 2015011132)；山西医科大学校级博士启动基金(No. 03201604)

△通讯作者 Tel: 0351-4135781; E-mail: luli@sxmu.edu.cn

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