贝伐单克隆抗体对二乙基亚硝胺诱导的原发性肝癌大鼠的防治作用及其对肝癌组织VEGF表达的影响

张锋利，田 华，吴洁琼

贝伐单克隆抗体对二乙基亚硝胺诱导的原发性肝癌大鼠的防治作用及其对肝癌组织VEGF表达的影响

张锋利，田 华，吴洁琼

目的研究抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体对二乙基亚硝胺（DEN）所致原发性肝癌大鼠的干预作用及其对肝组织VEGF表达的影响。方法将30只SD大鼠随机分为正常组、模型组和药物干预组。采用联合应用四氯化碳和DEN法制备原发性肝癌模型，并给予抗VEGF单克隆抗体腹腔注射干预，在正常组和模型组则给予等体积生理盐水注射。连续干预12 w。实验结束，取血和肝组织行相关检查，采用免疫组化法检测肝组织VEGF表达。结果药物干预组大鼠肝质量、肝表面癌结节数，癌变率和肝脏指数分别为（17.51±2.53）g、（6.86±0.82）个、30%和（4.10±0.79），均明显低于模型组的【（23.71±3.01）、（21.91±2.75）、100.0%和（5.90±1.01），P＜0.05】；与模型组比，药物干预组大鼠血清 AST、ALT和 TBIL水平分别为（101.58±19.83） IU/L、（241.52±36.58）IU/L和（62.93±3.03）μmol/L，均明显低于模型组（P＜0.05）；病理学检查结果显示，与模型组比，药物干预组动物肝组织损伤明显减轻；免疫组化检测结果则显示，模型组、正常组和药物干预组VEGF相对表达量分别为（35.21±6.92）、（1.00±0.00）和（11.53±3.81），差异显著（P＜0.05）。结论抗VEGF单克隆抗体对DEN诱导的原发性肝癌大鼠具有较好的抑瘤作用，而这种作用可能与其抑制了肝组织VEGF表达有关。

原发性肝癌；二乙基亚硝胺；抗血管内皮生长因子单克隆抗体；大鼠

作者单位：712000 陕西省宝鸡市 陕西中医药大学第二附属医院消化内科（张锋利，吴洁琼）；陕西中医药大学（田华）

原发性肝癌是我国死亡率高居第2位的癌症，约占所有恶性肿瘤死亡人数的20%[1，2]。因此，寻求一种肝癌的新型治疗方法是临床亟需攻克的重要课题[3，4]。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤血管生成过程中的关键蛋白之一，对于促进内皮细胞增殖及新生血管形成等具有重要的作用，也是目前抗肿瘤治疗的重要靶点[5，6]。贝伐单克隆抗体是一种新型抗VEGF单克隆抗体，对于非小细胞肺癌、结直肠癌和乳腺癌等均具有良好的治疗效果[7]。有部分研究显示抗VEGF抗体对肝癌具有一定的治疗疗效，发现其与顺铂等化疗药物联合用药对体外抑制肿瘤活性及对荷瘤小鼠有治疗作用[8]。本研究观察了抗VEGF单克隆抗体对二乙基亚硝胺（DEN）所致原发性肝癌大鼠的抑制作用，期望为临床应用该药治疗肝癌提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与动物 87HD型全自动定量酶标仪（武汉赛博公司），Olympus 78UI型显微照相系统（日本Olympus公司），RXL-01型全自动生化分析仪（美国安捷伦公司），X-22r型高速离心机（德国EP公司）。抗VEGF单克隆抗体（贝伐，美国Sigma公司，批号98120932），羧甲基纤维素钠（武汉博士德公司，批号 20150124），DEN（Sigma 公司，纯度＞99%，使用前配成DEN溶液100 mg/L，隔日更换，并避光存放），兔抗VEGF抗体（美国Sigma公司，批号98168127），检测血生化指标的试剂盒购自武汉博士德生物公司（批号分别为2014112309、201412 0987和2014123125）。清洁级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量【158.2±19.1）g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，生产许可证号：SCXK（陕）2014-0093】。

1.2 原发性肝癌模型的制备 取30只大鼠，随机分为正常组、模型组和药物干预组。按文献[10]报道的方法制备原发性肝癌模型，给予大豆油配制的50%四氯化碳溶液3 ml·kg-1于大鼠后肢皮下注射，2次/w，连续4 w。休息2 w，于第5 w开始，给予大鼠饮用95 μg/ml的DEN水溶液，每日新鲜配置，连续饮用12 w；在正常组大鼠，则在后肢皮下注射等量的大豆油，方法同上；在药物干预组大鼠自饮用DEN溶液的同时即开始给予抗VEGF单克隆抗体1.025 mg·kg-1腹腔注射，qod，在正常组和模型组则给予等体积的生理盐水注射，连续干预12 w。在末次给药24 h，用乙醚麻醉大鼠，于腹主动脉取血4 mL，低温离心 2 min（3000 r/m），分离血清，于 -80℃冰箱保存待检。取血完成后，采用放血法处死大鼠，剖开腹腔，剪取肝脏。称量肝脏质量，记录癌变只数，表面癌结节数，并计算癌变率（癌变只数/总数×100%）及肝脏指数（肝脏质量/体质量×100%）。取肝组织2块，1 cm×1 cm×1 cm，以10%甲醛溶液固定，分别用于组织病理学检查和免疫组化检测。

1.3 血生化指标检测 常规进行。

1.4 肝组织VEGF检测 采用sABC法行免疫组化染色，以DAB显色，在光学显微镜下观察到胞浆出现棕黄色颗粒者即为阳性细胞，在显微镜下每张切片观察10个高倍（400×）视野，采用Image-proplus 6.0图像分析软件对阳性染色细胞进行定量分析，取均值。

1.5 统计学处理 应用SPSS 22.0软件对数据进行处理，计量资料以（±s）表示，采用 t检验；用百分率描述计数资料，采用x2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏一般情况比较 与模型组比，正常组和药物干预组大鼠肝脏癌变率、肝脏质量、表面癌结节数和肝脏指数均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 各组大鼠肝脏一般指标（%，±s）比较

表1 各组大鼠肝脏一般指标（%，±s）比较

正常组与模型组比，①P＜0.05；药物干预组与模型组比，②P＜0.05

?

2.2 各组大鼠肝功能指标的比较 药物干预组大鼠血清AST、ALT和TBIL水平比模型组显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05，表 2）。

表2 各组大鼠肝功能指标（n=10，±s）的比较

正常组与模型组比，①P＜0.05；药物干预组与模型组比，②P＜0.05

?

2.3 各组大鼠肝组织病理学变化的比较 正常组大鼠肝组织细胞形态正常，以肝中央静脉为中心呈放射状向四周排列，管壁无增厚，门管区清晰，无炎性细胞浸润，肝小叶结构正常（图1A）；模型组大鼠癌细胞呈现不同程度的分化，癌细胞异型较为明显，核仁突出，排列成巢状（图1 B）；3只药物干预大鼠肝组织出现了癌变，癌细胞排列呈梁状，异型较为明显，核仁较为突出，间质少，可见出血（图1 C）。其余未出现癌变的7只大鼠肝组织内存在坏死性肝硬化，可见较宽的纤维间隔和形态不一的假小叶，肝细胞不同程度的变性、水肿及坏死（图1 D）。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现（HE，400×）A：正常组；B：模型组；C：药物干预癌变组；D：药物干预未癌变组

2.4 各组大鼠肝组织VEGF表达情况比较 肝组织VEGF阳性呈棕黄色，分布于细胞核中，呈弥漫性颗粒状分布。模型组大鼠肝组织VEGF呈强阳性表达，药物干预组呈阳性表达，强度明显弱于模型组，正常大鼠肝组织偶见VEGF阳性细胞（图2）。定量分析结果显示，模型组、正常组和药物干预组VEGF相对表达量分别为（35.21±6.92）、（1.00±0.00）和（11.53±3.81），差异显著（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肝组织VEGF表达情况（sABC，400×）A：正常组；B：模型组；C：药物干预癌变组；D：药物干预未癌变组

3 讨论

肝癌是目前临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一。随着肝切除术技术的迅猛发展及其他临床医学的不断进步，较以往而言肝癌的临床治疗疗效已取得了较大的进步。但总体来说，肝癌患者长期生存率仍不容乐观，还需要对患者进行更系统的优化治疗[11-13]。VEGF是一种高度特异性的新型促血管内皮细胞生长因子，由2个分子质量1.7～2.2万的糖蛋白亚单位所组成，相对分子质量范围为3.1～4.3万。该蛋白可通过特异性结合血管内皮细胞表面受体而发挥改变细胞外基质、促进内皮细胞增殖、促进新生血管形成及增加血管通透性等生物学效应[14，15]。抗VEGF单克隆抗体是目前全球第一个被批准用于治疗肿瘤患者的药物，能发挥血管生长抑制作用，对VEGF的生物效应产生特异性阻断作用，从而产生肿瘤血管新生抑制作用，延缓肿瘤的生长和转移[16，17]。迄今为止，美国FDA已批准该药用于转移性乳腺癌、转移性结直肠癌及晚期非小细胞肺癌等疾病的治疗[18]。近期，抗VEGF单克隆抗体在肝癌中的应用亦取得令人鼓舞的结果，但相关研究主要为临床疗效观察。在体外表现出抗肿瘤细胞活性，抑制荷瘤小鼠肿瘤生长[19，20]。我们应用抗VEGF单克隆抗干预DEN所致原发性肝癌大鼠，发现其也具有预防或抑制肿瘤生长作用，或许为将其应用于临床提供一定的实验依据。

本研究在造模方法上，首先利用氯仿攻击肝细胞，导致肝细胞变性坏死，促进肝细胞的修复及增生，然后采用DEN对增殖状态下的肝细胞进行攻击，可最大程度地发挥致癌效果，该方法亦是经典原发性肝癌造模手段之一。结果显示本研究模型大鼠均造模成功，亦再次证实了该方法的可靠性[21]。在药物干预组大鼠，癌变率、肝脏质量、表面癌结节数及肝脏指数均低于模型组，病理学观察结果亦显示，抗VEGF单克隆抗体具有降低DEN诱导大鼠癌症发生的作用。此外，药物干预大鼠血清ALT和AST等肝功能生化指标均明显低于模型组，提示抗VEGF单克隆抗体可有效缓解DEN所致的肝损伤。本研究采用免疫组化检测，发现模型组大鼠肝组织VEGF强阳性，药物干预组阳性程度减低。定量分析结果显示，药物干预组肝组织VEGF表达量明显低于模型组，提示抗VEGF单克隆抗体可通过抑制原发性肝癌大鼠VEGF的表达，抑制肿瘤血管生成，最终发挥其抗癌作用。

尽管本课题结果较为客观，但仍存在部分问题。首先，本研究虽根据药物说明书选用了准确的给药剂量，未对剂量进行调整，但作为动物实验，后期研究中还应适当改变剂量，用于探讨药物的量效关系；其次，尽管抗VEGF单克隆抗体的药物作用机制较为明确，本研究亦得到了完全吻合的结果，但其治疗效果是否还存在其他的机制或作用通路，也是值得深入发掘的一项重要工作，后期还需完善；最后，由于动物实验与人体实际的差别，本研究结论是否适合于临床，还需要进行长期的验证性研究。

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（收稿：2016-10-28）

（本文编辑：陈从新）

Inhibition of tumor growth and vascular endothelial growth factor expression of bevacizumab in rats with diethylnitrosamine-induced hepatic neoplasma

Zhang Fengli，Tian Hua，Wu Jieqiong.Department of Gastroenterology，Second Affiliated Hospital，Shaanxi TCM University，Baoji 712000，Shaanxi Province

Objective To investigate the inhibition of tumor growth and vascular endothelial growth factor（VEGF） expression of bevacizumab in rats with diethylnitrosamine-induced hepatic neoplasma.Methods 30 SD rats were randomly divided into control，modeland bevacizumab-intervened groups.The combination of tetrachloromethane and diethylnitrosamine（DEN）were used to establish liver cancer in rats. The bevacizumab or saline was given intraperitoneally for 12 weeks.The sera and liver tissues were obtained.The liver weights，surface carcinoma nodule numbers，canceration rates and liver index were detected.The VEGF expression was stained immunohistochemically.Results The liver weights，surface carcinoma nodule numbers，canceration rates and liver index were （17.51 ±2.53） g，（6.86 ±0.82），30% and （4.10 ±0.79） in the bevacizumab-intervened group，significantly lower than those in the model group [（23.71 ±3.01），（21.91 ±2.75），100.0% and （5.90 ±1.01），respectively，P ＜0.05]；serum AST，ALT and TBIL levels were （101.58 ±19.83） IU/L，（241.52 ±36.58） IU/L and（62.93±3.03） μmol/L in the bevacizumab-intervened group，significantly lower than those in the model group（P＜0.05）；Liverpathologicalexamination showed thatthe liverinjures，canceration and VEGF expression were alleviated in the bevacizumab-intervened group.Conclusions The application of Bevacizumab has a good inhibitory effect on DEN-induced canceration in rats，which warrants further study.

Hepatoma；Diethylnitrosamine；Bevacizumab；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.014

张锋利，女，37岁，大学本科，副主任医师。主要从事肝脏病和功能性胃肠病防治研究。E-mail:zhangfengli197902@163.com

吴洁琼，E-mail:2962128717@qq.com