不同种小鼠乙型肝炎模型的建立及其感染状况研究*

周 云，李 盛，唐宗生，杨东亮，宋景娇

不同种小鼠乙型肝炎模型的建立及其感染状况研究*

周 云，李 盛，唐宗生，杨东亮，宋景娇

目的探讨建立急性或慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染小鼠模型的方法。方法采用高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2表达质粒，建立急性或慢性HBV感染小鼠模型，采用ELISA法检测HBV抗原，采用RT-PCR法检测免疫相关分子基因，使用FACS检测肝内淋巴细胞活化情况，采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）法检测脾脏相关免疫细胞特征。结果成功建立急性和慢性高压尾静脉注射HBV感染小鼠模型；在急性BALB/c小鼠模型，血清HBsAg持续时间分别为（3.25±1.04） w，显著短于慢性 C57BL/6 小鼠组【（10.0±3.74）w，P＜0.05）】；在 BALB/c小鼠模型，注射2.5 μg病毒质粒小鼠血清HBsAg持续时间为（3.67±1.03）w，显著长于注射50 μg组【（2.33±0.52）w，（P＜0.05）】；在高压尾静脉注射后第10 d，BALB/c小鼠脾脏出现了HBcAg特异性T淋巴细胞。结论成功建立高压尾静脉注射HBV感染小鼠模型，发现宿主遗传背景、免疫应答状态和病毒剂量影响HBV感染小鼠模型的建立。

乙型肝炎；pAAV/HBV1.2表达质粒；高压尾静脉注射；小鼠

作者单位：430022武汉市 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染性疾病科（周云，李盛，唐宗生，杨东亮）；附属同济医院实验医学中心（宋景娇）；河南大学医学院（周云）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈全球范围广泛流行，慢性感染者达3.5亿人。因此，HBV感染是全球一大公共卫生问题[1，2]。HBV感染可引起急性和慢性肝炎，并与肝硬化和肝癌的发生密切相关。成人感染HBV后通常表现为急性自限性肝炎，仅有5%会发展为慢性感染，而新生儿感染后约90%发展为慢性感染。然而，HBV慢性感染的机制尚不明确[3]。为了研究HBV感染的免疫病理发生机制，迫切需要建立合适的动物模型。小鼠为目前应用最广泛的实验动物之一，遗传背景清晰，其免疫学特征已被广泛研究。HBV转基因小鼠模型已成为广泛应用的小鼠模型。但是，小鼠属于免疫耐受模型，不适合研究HBV清除机制[4]。因此，我们建立一种简便、快捷、经济实用的高压尾静脉注射感染HBV小鼠模型，可用于急慢性HBV感染的致病机制研究。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 SPF级雄性BALB/c和C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量为18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心。所有动物实验均符合本校动物实验伦理学委员会的规定。pAAV和pAAV/HBV1.2质粒由台湾大学陈培哲教授惠赠。检测HBsAg试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司；Endo-free Plasmid Maxi Kit购自美国OMEGA公司；ONE Step SYBR PrimerScript RT-PCR Kit购自日本TAKAR公司；动物组织总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；酶联免疫斑点检测试剂盒（ELISPOT）购自深圳达科为生物技术有限公司。重组HBcAg和HBsAg购自以色列ProSpec公司。PE标记抗鼠CD69抗体及同型对照购自美国Ebioscience公司。本实验所用引物均购自德国QIAGEN公司。

1.2 HBV感染小鼠模型的建立 将10 μg重组质粒pAAV/HBV1.2溶于相当于小鼠体质量10%的生理盐水，混匀后转移至注射器备用。用75%酒精消毒小鼠尾部，再用远红外理疗仪照射2～3 min，致小鼠尾静脉充盈并清晰可见，在尾静脉末端1/3处注入HBV重组质粒，在5～8 s内完成注射。在高压尾静脉注射后定期采血，连续采血12 w。采血方法为，给予1%戊巴比妥钠150 μl腹腔注射，麻醉后用灭菌毛细管从小鼠眼眶内侧采血约300 μl，离心分离小鼠血清，冻存于-80℃。在高压尾静脉注射后第10、20、30 d处死小鼠，取肝组织，部分肝组织用10%中性福尔马林固定，用于石蜡切片，另一部分肝组织置液氮冻存后保存于-80℃冰箱。

1.3 血清HBsAg检测 采用双抗夹心ELISA法检测，将小鼠血清与1×PBS按照1:10比例稀释，充分混匀后加入96孔板，每孔加稀释血清50 μl，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，再加等体积的酶结合物，轻轻混匀，37℃孵育1 h，洗板5次，加显色剂A液和B液各50 μl，37℃孵育30 min，加终止液50 μl，在酶标仪读取450 nm吸光度值。

1.4 肝组织免疫相关分子mRNA检测 取肝组织20 mg，加裂解液RL 300 μl，用研磨棒研磨组织，然后加入去离子水590 μl和蛋白酶K 10 μl，混匀后56℃水浴20 min。离心后取上清，缓慢加入0.5倍无水乙醇，转入吸附柱中，离心后弃废液，再加入去蛋白液350 μl，离心后弃液，再向柱中加入DNaseⅠ,离心后弃液，再加入漂洗液 500 μl，最后加去离子水50 μl，洗脱。以总RNA为模板，采用RT-PCR法检测细胞因子和CD分子mRNA水平，按照 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit说明配制反应体系，PCR反应条件为95℃ 5 s，60℃20 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用Pfaffl法计算目的基因水平。

1.5 小鼠脾细胞抗原刺激反应检测 在高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2后20 d，给予1%戊巴比妥200 μl腹腔注射，麻醉小鼠，摘眼球采血，断颈处死小鼠，无菌分离小鼠脾脏，用玻璃注射器活塞研磨脾脏，使用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调整细胞密度至4×106个细胞/毫升。接种脾淋巴细胞于96孔ELISPOT包被板，加抗原刺激物HBcAg、HBsAg、CMV 和 ConA，终浓度为 0.5 μg/ml，在37℃，5%CO2培养箱无菌培养30～36 h，在培养过程中不移动培养板。待斑点显色反应，扣出孔内培养基，加入冰冷的去离子水200 μl，4℃静置10 min，细胞处于低渗而裂解，用1×Washing Buffer洗板5次，加生物素标记抗体100 μl，37℃孵育1 h，洗板5次，再加酶联亲和素100 μl，37℃孵育1 h，洗板，加AEC显色工作液100 μl，室温避光静置15～45 min，自来水冲洗板子正反面3～5次，终止显色，采用ELISPOT斑点计数仪计数细胞。

1.6 肝内淋巴细胞活化检测 在高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2后第10 d、20 d和30 d，给予小鼠1%戊巴比妥200 μl腹腔内注射，采血后断颈，处死小鼠，放置于75%酒精中浸泡3 min，切开皮肤和腹膜，暴露肝脏，将PBS10 ml缓慢通过肝门静脉灌洗肝脏，将肝脏放置于70 μm滤网中研磨，加胶原酶Ⅱ裂解肝组织，用lympholyte-M液分离肝内淋巴细胞。加荧光抗体表面染色，每孔肝内淋巴细胞加PBS 100 μl，洗涤1次，加入抗PE-CD69抗体或同型对照（1:100），每孔 50 μl，4℃避光，抗原抗体结合反应30 min，再用PBS洗涤1次，在流式细胞仪Calibur检测，观察肝内T淋巴细胞活化情况。

1.7 统计分析 应用GraphPad Prism软件作图，应用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以（±s）表示，采用两独立样本 t检验，对血清HBsAg阳性持续率采用Kaplan-Meier分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同小鼠血清HBsAg水平变化比较 在注射相同剂量的pAAV/HBV1.2情况下，BALB/c小鼠血清HBsAg持续时间为（3.25±1.04）w，显著低于C57BL/6 组【（10.0±3.74）w，P＜0.01）】；自高压尾静脉注射后第1 d～注射后第12 w，经Kaplan-Meier分析，C57BL/6小鼠HBsAg持续阳性率显著高于BALB/c小鼠（P＜0.05，图 1），说明我们成功建立了高压尾静脉注射HBV感染小鼠模型，但是小鼠遗传背景影响了HBsAg阳性持续时间。

图1 不同遗传背景小鼠血清HBsAg阳性水平和持续时间比较A：C57BL/6小鼠血清HBsAg阳性水平显著高于BALB/c小鼠；B：C57BL/6小鼠血清HBsAg阳性持续时间显著长于BALB/c 小鼠（n=8～14）

2.2 注射病毒剂量影响HBV持续时间 在BALB/c小鼠模型，注射 pAAV/HBV1.2 2.5 μg，血清HBsAg阳性持续时间为（3.67±1.03）w，显著长于50 μg 剂量组【（2.33±0.52） w，P＜0.05，图 2A】；经Kaplan-Meier分析，注射2.5 μg剂量组小鼠血清HBsAg阳性率显著高于50 μg剂量组（P＜0.05，图2B）。我们发现，在一定注射剂量范围内，注射病毒质粒质量越多，血清HBsAg清除速度越快。

图2 注射不同剂量pAAV/HBV1.2质粒BALB/c小鼠血清HBsAg阳性水平和持续时间比较A：在BALB/c小鼠模型，经高压尾静脉注射不同剂量pAAV/HBV1.2后，发现注射小剂量组（2.5 μg）小鼠HBsAg阳性水平显著高于大剂量组（50 μg）小鼠；B：注射不同剂量pAAV/HBV1.2小鼠，血清HBsAg阳性持续时间比较，经Kaplan-Meier分析，发现大剂量组小鼠血清HBsAg持续时间反而显著短于小剂量组小鼠（n=6）

2.3 不同遗传背景小鼠肝组织免疫相关分子水平比较 在高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2后第4 d，BALB/c小鼠和 C57BL/6小鼠肝组织 IFN-γ、IL-10、TGF-β和PDL-1 mRNA水平差异无统计学意义，但C57BL/6小鼠肝组织IL-6和FOXP3 mRNA 水平显著高于 BALB/c小鼠（P＜0.05，图 3），暗示C57BL/6小鼠血清HBsAg持续阳性可能与肝内免疫负调控分子FOXP3表达升高有关。

2.4 肝内T淋巴细胞活化动态变化 给予BALB/c小鼠高压尾静脉注射pAAV空载体对照质粒或pAAV/HBV1.2各10 μg，在注射后第10 d，注射pAAV/HBV1.2组小鼠肝内CD69+/CD8+T淋巴细胞活化比例显著升高，在第20 d和30 d下降（P＜0.05，图4）。

图3 不同遗传背景小鼠肝组织免疫相关分子mRNA水平比较 在高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2后第4 d，发现C57BL/6小鼠肝组织IL-6和FOXP3 mRNA水平显著高于BALB/c小鼠

图4 肝内CD8+T淋巴细胞CD69分子动态变化 在BALB/c小鼠模型，在注射pAAV/HBV1.2后第10 d，肝内 CD8+T淋巴细胞被活化，而在第20 d和30 d，却不再见到T淋巴细胞被活化

2.5 HBsAg和HBcAg特异性T淋巴细胞数量的比较 BALB/c小鼠在高压尾静脉注射pAAV或pAAV/HBV1.2 10 μg后第20 d，以分泌IFN-γ为特征，未发现HBsAg特异性T细胞，而HBcAg特异性T细胞数量显著增加（P＜0.05，图5），说明HBcAg能致敏淋巴细胞，可能在清除HBV感染过程中发挥作用。

图5 HBsAg和HBcAg特异性T细胞数量变化 在BALB/c小鼠模型，经高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2后第20 d，未见HBsAg特异性T细胞，而HBcAg特异性T细胞数量显著增加（P＜0.05）

3 讨论

HBV感染宿主范围狭窄，目前仅人类和黑猩猩可感染HBV。由于伦理及经费等问题，应用黑猩猩进行科学研究受到了限制。HBV转基因小鼠属于免疫耐受模型，无法用于HBV自限性清除的研究[3，5]。本实验将pAAV/HBV1.2质粒经高压尾静脉注射BALB/c小鼠体内，产生急性HBV复制过程，模拟人类急性自限性感染过程[4，6，7]。该模型既探讨了HBV清除机制，又为HBV感染小鼠模型的建立提供技术上的支持。

HBV清除与动物遗传背景和年龄相关。我们的实验结果证明HBV在C57BL/6小鼠体内清除速度慢于BALB/c小鼠，与BALB/c小鼠对HBsAg所产生的特异性免疫应答强于C57BL/6小鼠有关[8]。宿主年龄越大，清除HBV速率越快，免疫功能健全的成人感染后常为自限性感染，而婴幼儿感染多为持续性慢病毒感染[9，10]。

注射的病毒剂量影响HBV感染的持续时间[11，12]。具有正常免疫功能的小鼠，在给予小剂量的HBV腺病毒载体后，可以导致HBV感染持续存在，而大剂量HBV注射将导致病毒被快速清除[13]。

适应性免疫通常被认为在清除HBV方面发挥重要的作用[14，15]。病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）直接与感染的肝细胞接触，并杀伤清除肝细胞。然而，这并不是最有效的清除方式[16]。特异性CTL分泌IFN-γ，通过抑制病毒复制及衣壳体组装而呈非溶解性清除病毒[17，18]。在急性自限性感染时，HBV DNA在病毒复制高峰后2～3周下降90%，肝脏不出现明显的病理性损伤，说明CD8+T细胞分泌的 IFN-γ 等细胞因子能非溶解性清除 HBV[14，19，20]。我们在急性HBV感染小鼠模型检测到HBcAg特异性分泌IFN-γ的T淋巴细胞，因而认为HBcAg或其形成的核衣壳在清除HBV感染过程中起一定的作用。

[1]Burns GS，Thompson AJ.Viral hepatitis B:clinical and epidemiological characteristics.Cold Spring Harb Perspect Med，2014，4（12）:a024935.

[2]Liaw YF Chu CM.Hepatitis B virus infection.Lancet，2009，373（9663）:582-592.

[3]中华医学会肝病学分会和感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）.实用肝脏病杂志，2016，19（3）：Ⅴ-ⅩⅩⅢ.

[4]Huang LR，Wu HL，Chen PJ，et al.An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 （47）:17862-17867.

[5]Thomas E，Liang TJ.Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2016，13（6）:362-374.

[6]Yang PL，Althage A，Chung J，et al.Hydrodynamic injection of viral DNA:a mouse model of acute hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（21）:13825-13830.

[7]Lin YJ，Wu HL，Chen DS，et al.Hepatitis B virus nucleocapsid but not free core antigen controls viral clearance in mice.J Virol，2012，86（17）:9266-9273.

[8]Milich DR，Chisari FV.Genetic regulation of the immune response to hepatitis B surface antigen （HBsAg）.I.H-2 restriction of the murine humoral immune response to the a and d determinants of HBsAg.J Immunol，1982，129（1）:320-325.

[9]Chou HH，Chien WH，Wu LL，etal.Age-related immune clearance of hepatitis B virus infection requires the establishment of gut microbiota.Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（7）:2175-2180.

[10]Guidotti LG，Chisari FV.Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis.Annu Rev Pathol，2006，1:23-61.

[11]Tian Y，Chen WL，Kuo CF，et al.Viral-load-dependent effects of liver injury and regeneration on hepatitis B virus replication in mice.J Virol，2012，86（18）:9599-9605.

[12]Asabe S，Wieland SF，Chattopadhyay PK，et al.The size of the viral inoculum contributes to the outcome of hepatitis B virus infection.J Virol，2009，83（19）:9652-9662.

[13]Huang LR，Gabel YA，Graf S，et al.Transfer of HBV genomes using low doses ofadenovirus vectors leads to persistent infection in immune competent mice.Gastroenterology，2012，142（7）:1447-1503.

[14]Guidotti LG，Rochford R，Chung J，et al.Viral clearance without destruction ofinfected cells during acute HBV infection.Science，1999，284（5415）:825-829.

[15]Guidotti LG，Chisari FV.Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response.Annu Rev Immunol，2001，19:65-91.

[16]Chisari FV，Isogawa M，Wieland SF.Pathogenesis of hepatitis B virus infection.Pathol Biol，2010，58（4）:258-266.

[17]Guidotti LG，Isogawa M，Chisari FV.Host-virus interactions in hepatitis B virus infection.Curr Opin Immunol，2015，36:61-66.

[18]Tan A，Koh S，Bertoletti A.Immune response in hepatitis B virus infection.Cold Spring Harb Perspect Med，2015，5（8）:a021428.

[19]Wieland S，Thimme R，Purcell RH，et al.Genomic analysis of the host response to hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（17）:6669-6674.

[20]Thimme R，Wieland S，Steiger C，et al.CD8（+） T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection.J Virol，2003，77（1）:68-76.

（收稿：2016-10-26）

（本文编辑：陈从新）

Establishment of hepatitis B virus infection model in different mice by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid

Zhou Yun，Li Sheng，Tang Zongsheng，et al.Department of Infectious Disease，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Hepatitis B；pAAV/HBV1.2 plasmid；Hydrodynamic injection；Mice

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.007

国家传染病防治科技重大专项项目（编号：2008ZX10002-011）

周云，男，36岁，医学博士。主要从事感染与免疫研究。E-mail:zyky120@126.com

宋景娇，E-mail:jjsong@tjh.timu.edu.cn

【Abstrat】Objective To establish the acute or chronic HBV-infection mouse model.Methods Acute or chronic HBV-infection mouse model was established by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid.Serum HBsAg were detected by ELISA.The immune-related molecule mRNA were detected by real-time PCR.The activated lymphocytes in the livers were detected by FACS and ELISPOT was used to detect the HBV-specific cellular immune response.Results We successfully established the acute and chronic HBV-infection mouse model by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid；The duration of serum HBsAg secretion in acute HBV-infected BALB/c mice was （3.25±1.04） weeks，significantly shorter than that in chronic HBV-infected C57BL/6 mice[（10.0±3.74） weeks，P＜0.05]；The duration of serum HBsAg secretion in BALB/c mice injected with low dose （2.5μg） of pAAV/HBV1.2 plasmid was（3.67±1.03） weeks，significantly longer than that in high dose（50μg） group[（2.33 ±0.52） weeks，P ＜0.05]；On the tenth day after hydrodynamic injection，HBcAg special T lymphocytes appeared in the spleen of BALB/c mice.Conclusion HBV-infection mouse model is successfully established by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid and we find that mouse genetic background，immune response and viral doses will impact the establishment of this kind of HBV-infection mouse model.