茯茶冠突散囊菌发酵生产吲哚生物碱的研究

2017-10-19刘丽萍唐雨薇王若娴李志冰刘仲华刘硕谦

茶叶科学 2017年5期

关键词：茯茶砖茶吲哚

刘丽萍，唐雨薇，王若娴，李志冰，刘仲华 ,3，刘硕谦,3*

1. 湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙 410128；3. 教育部茶学重点实验室，湖南长沙410128

茯茶冠突散囊菌发酵生产吲哚生物碱的研究

刘丽萍1,2，唐雨薇1,2，王若娴1，李志冰1，刘仲华1,2,3，刘硕谦1,2,3*

1. 湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙 410128；3. 教育部茶学重点实验室，湖南长沙410128

冠突散囊菌是茯砖茶“发花”过程中的优势菌，其体内含有丰富的吲哚类生物碱类代谢产物。吲哚生物碱类化合物具有抗菌、抗过敏、抗辐射、抗紫外和抗肿瘤等重要的生物活性，开发前景广阔。为提高吲哚类生物碱类代谢产物的产量，本研究考察了冠突散囊菌繁殖、生长与发酵的影响因素，并利用薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对其发酵产物内含成分进行了分析。结果表明冠突散囊菌在察氏固体培养基上能快速繁殖，8 d内能产生大量的成熟孢子，液体培养的最佳条件与时长分别为pH 6.0、温度30℃、转速200 r·min-1和培养时长6 d；鲜茶干粉、鲜茶提取物、茯茶粉、茯茶提取物和色氨酸等能显著诱导吲哚生物碱的合成，其中色氨酸诱导效应最强；内含成分分析表明，TLC可分离出至少10种冠突散囊菌代谢物质，HPLC与LC-MS检测分析其代谢产物的主要成分为吲哚类生物碱，产量达到2.45 g·L-1。本研究为茯茶冠突散囊菌的高值化开发提供了技术支撑。

冠突散囊菌；发酵条件；吲哚类生物碱；内含成分分析

茯茶，也叫茯砖茶，在我国六大茶类中属于黑茶，是一种后发酵茶，也是全发酵茶。茯茶最初作为一种边销茶，是中国西北、蒙古等游牧民族地区的特需商品[1]。随着茯茶的逐渐流行，目前已被销往全国各地，而且销售量逐年增长。传统饮用茯砖茶，主要用于促进消化、健脾、养胃、健胃、瘦身等健康方面[1-5]。长期饮用茯茶，能够促进人体新陈代谢、提高免疫力、增强体质、延缓衰老，具有明显的药理保健和病理预防作用。现代药理研究表明，茯砖茶具有降血脂、降血糖、抗辐射、抗氧化等功效[6-8]。近年来，国内外学者对茯茶的活性成分的发掘研究越来越多。从目前的研究结果来看，绝大多数学者认为冠突散囊菌（Eurotium Cristatum）对茯茶的品质和药理功效的发挥起了重要作用[9-10]。冠突散囊菌（E. Cristatum）在茯茶中称作“金花菌”，属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种灰绿色曲霉真菌，适合在土壤、茯砖茶、冬虫夏草、中药片和木屑中生长。冠突散囊菌是小冠曲霉（Aspergilus cristatellus）的有性型，由子囊果和菌丝组成。冠突散囊菌的子囊果直径为150～200 μm，通常有黄色球形或近球形闭囊壳，子囊果破裂后可释放出直径为5 μm的球形、近球形或双凸镜形子囊孢子。冠突散囊菌的菌丝呈白色，直径8～10 μm。一般来说，在茯砖茶进行发花第 6天冠突散囊菌开始进入对数生长期，并抑制其他细菌与霉菌的生长，成为茯茶发酵中的优势菌，发花至 12 d进入衰退期[11]。冠突散囊菌能生产丰富的天然活性成分，从而赋予了茯砖茶特有的色、香、味，也是茯砖茶促消化、降脂减肥、抑制肿瘤细胞和治疗心血管疾病等保健功效的物质基础。邓放明等[12]利用冠突散囊菌发酵液分离出胞外多糖，选用 PPARs、K526、HepG2模型初步研究其降脂和抗肿瘤活性，发现胞外多糖对PPARα、PPARγ、PPARδ 3种模型均有活性。吕嘉枥等[13]对冠突散囊菌发酵液进行了研究，证明冠突散囊菌液体发酵液提取液中含有降脂成分洛伐他汀，分别为酸式洛伐他汀和酯式洛伐他汀。宋鲁彬等[14]发现茯砖茶石油醚洗脱组分中含有大量的色素物质。Du等[15]从海洋冠突散囊菌中分离到了 cristatumin A、cristatumin B、cristatumin C、cristatumin D、neoechinulin A、isoechinulin A, variecolorin G、preechinulin、tardioxopiperazine A和echinulin等化合物。Zou等[16]首次对茯砖茶中冠突散囊菌的次生代谢产物进行了系统分析，发现茯茶冠突散囊菌生产 1种新的异戊烯基吲哚生物碱cristatumin F，除此之外茶冠突散囊菌还生产echinulin、dehydroechinulin、neoechinulin A和variecolorin O等其他异戊烯基吲哚生物碱类化合物。业已证实，异戊烯基吲哚生物碱类化合物具有重要的生物活性，比如抗菌、抗过敏、抗辐射、抗紫外和抗肿瘤等[17-19]。因此，对茯茶冠突散囊菌进行开发具有重要的应用前景。本研究深入探讨茯茶冠突散囊菌中吲哚生物碱生物合成的影响因素，为茯茶冠突散囊菌的深度开发提供重要技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料来源

冠突散囊菌由湖南农业大学茶学教育部重点实验室提供，由黄浩博士分离鉴定并保存。

1.2 冠突散囊菌的培养方法

1.2.1 固体繁殖培养

CZA固体培养基（察氏固体培养基，Czapek-Dox Medium）按如下方法制作：准确称取硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、硝酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂粉 15 g，加 1 000 mL蒸馏水，于 121℃灭菌20 min。

1.2.2 液体生长培养

取1 mL冠突散囊菌孢子粉，50℃孵育10 min，接种于10 L液体生长培养基上进行生长期培养，液体生长培养基以CZA液体培养基为基础培养基。CZA液体培养基按如下方法制作：准确称取硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、硝酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、碳酸钙2 g，加1 000 mL蒸馏水，于121℃灭菌20 min。

1.3 影响冠突散囊菌生长速度的因素

1.3.1 pH

将CZA液体培养基pH分别调至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，取50 mL CZA液体培养基加入200 mL的三角锥形瓶，接种后28℃震荡培养（200 r·min-1）7 d后收集菌液，5 000 r·min-1离心6 min，去上清，用蒸馏水洗涤3次，收集其菌丝球，40℃烘干，至恒重后取出称重。

1.3.2 培养温度

将CZA液体培养基pH值调至最适合冠突散囊菌生长的pH，取50 mL CZA液体培养基加入200 mL的三角锥形瓶，接种后分别在不同的温度（24～34℃）条件下震荡培养（200 r·min-1）7 d后收集菌液，5 000 r·min-1离心6 min，去上清，用蒸馏水洗涤3次，收集其菌丝球，40℃烘干，至恒重后取出称重。

1.3.3 震荡速度

在最佳pH和最佳温度28℃下，分别在不同的震荡速度下（120～220 r·min-1）培养 7 d后收集菌液，并计算菌丝球的干重。

1.3.4 培养时间

在最佳培养条件下，分别培养不同的时间（3～8 d），并计算菌丝球的干重。

1.4 添加物对吲哚生物碱合成的影响

在液体生长培养基上培养适当时间后（第5天），转入发酵培养基中进行发酵培养。发酵培养基是在液体生长培养基的基础上分别添加5 g·L-1的茶叶干粉、茯茶粉、茯茶提取物和色氨酸，以5-羟色胺为标准品，采用分光光度法测定发酵产物中吲哚生物碱的含量[20]。

1.5 发酵产物的提取

发酵完成后，收集菌体和取发酵液，超声30 min，加入100 mL乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，用2 mL甲醇溶液重悬，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液于冰箱保存。

1.6 发酵产物的检测方法

1.6.1 薄层色谱

取样品溶液用毛细管点样与 TLC硅胶板上，采用Ⅰ和Ⅱ展开剂展开。Ⅰ展开剂为石油醚︰乙酸乙酯（6︰4）溶液；Ⅱ展开剂为石油醚︰乙酸乙酯（9︰1）溶液。展开完成后，分别在碘蒸气与紫外光（366 nm 波长）下观察并成像。

1.6.2 高效液相色谱

取150 μL样品溶液，用甲醇稀释至1.5 mL，有机超滤膜过滤，在高效液相色谱仪（安捷伦LC-1260高效液相色谱仪）上进行成分分析。色谱条件为：色谱柱GL Science WondasilTM C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温30℃，检测波长 290 nm，检测器为二极管阵列检测器，流动相 A为 5%（V/V）磷酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序如下：0～30 min，流动相 B由 5%上升到 60%，30～60 min，流动相B上升到80%，流速为1 mL·min-1，进样量为10 μL。

1.6.3 液质联用

采用与HPLC相同的流动相与洗脱程序。采用电喷雾离子源（ESI），正负离子扫描模式，扫描范围设置在 100～1 500 m·z-1之间；雾化室压力为 300 kPa，离子源温度设为345℃，干燥气流速为11 L·min-1。

1.7 数据分析方法

每个处理做3个重复实验，采用SPSS数据分析软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 冠突散囊菌在CZA培养基上的生长情况

为了快速获得冠突散囊菌孢子，考察了冠突散囊菌在CZA固体培养基上的生长、产孢速度情况，结果如图 1所示。冠突散囊菌在CZA培养基上生长速度快，4 d后能长满整个平板并开始产孢子，6 d后孢子产量达到最高峰并有部分孢子开始成熟，8 d后孢子完全成熟。由此可见，CZA培养基适合冠突散囊菌的生长与繁殖。

图1 冠突散囊菌在CZA培养基上的生长情况Fig. 1 Culture of Eurotium cristatum on Czapek-Dox solid medium

2.2 发酵条件对冠突散囊菌生长速度的影响

2.2.1 pH

为了提高冠突散囊菌的生长速度，考察了pH值对冠突散囊菌生长速度的影响。结果表明（图 2），pH对冠突散囊菌生长速度的影响非常明显，在低pH值下，冠突散囊菌生长非常缓慢，pH值在5.5～7.0之间适宜冠突散囊菌的生长，而在pH 6.0的条件下冠突散囊菌生长速度最快，因此在后续研究中采用pH值6的培养基。

图2 pH对冠突散囊菌生长速度的影响Fig. 2 Effect of pH on growth of Eurotium cristatum

2.2.2 培养温度

在确定了最佳pH值的基础之上，考察了培养温度对冠突散囊菌生长速度的影响。结果表明（图3），培养温度在24～34℃之间，冠突散囊菌生长速度呈抛物线变化，在低温和高温条件下，冠突散囊菌生长均受到抑制，28～30℃适合冠突散囊菌，而在培养温度30℃时冠突散囊菌生长速度最快。

图3 培养温度对冠突散囊菌生长速度的影响Fig. 3 Effect of culture temperature on growth of Eurotium cristatum

2.2.3 震荡速度

确定了最佳pH值和最佳温度之后，笔者考察了震荡速度对冠突散囊菌生长速度的影响。结果表明（图4），冠突散囊菌的生长速度基本上随着震荡速度的增加而加快，转速为200 r·min-1时冠突散囊菌的生长最快，随后有所下降，因此200 r·min-1的震荡速度最适合冠突散囊菌生长。

图4 震荡速度对冠突散囊菌生长速度的影响Fig. 4 Effect of different rotation speeds on growth of Eurotium cristatum

2.2.4 培养时间

为进一步提高冠突散囊菌产量，考察了震荡培养时间对冠突散囊菌产量的影响。结果表明（图5），起初，随着震荡培养时间的增加，其产量急剧增加，但培养 5 d增长速度开始减缓，到第6天产量达最高峰，第7天后产量有所降低。可见，冠突散囊菌在第3天开始进入对数生长期，第6天开始进入平稳期，第7天开始有溶菌现象。因此，震荡培养 6 d为最佳培养时间，而第5天可以进入发酵培养阶段。

图5 培养时间对冠突散囊菌生长速度的影响Fig. 5 Effect of different culture time on growth of Eurotium cristatum

2.3 添加物对吲哚生物碱合成的影响

为了提高冠突散囊菌次生代谢产物的量，培养5 d后转入发酵培养，并考察了不同添加物对吲哚生物碱产量的影响。结果表明（图6），考察的各种添加物均能显著提高发酵产物中吲哚生物碱的含量，其中茯茶粉及茯茶提取物提高吲哚生物碱产量的能力最低，鲜茶干粉次之，鲜茶提取物提高吲哚生物碱产量的能力较高，而色氨酸提高吲哚生物碱产量的能力最高（P＜0.01），产量达到(2.45±0.19) g·L-1（图6）。

2.4 发酵产物TLC分析

为进一步分析冠突散囊菌次生代谢产物，首先对其发酵产物进行了TLC分析，结果如图 7所示。冠突散囊菌次生代谢产物非常丰富，至少可检测到10种以上的化合物。采用Ⅰ展开剂可分离到约8个化合物，但TLC最顶端有 1个明显的椭圆形斑点，推测该斑点是几个极性较低的化合物没有完全分离（图7）。为分离这些物质，笔者采用了极性较低的Ⅱ展开剂对代谢产物进行了分析，结果显示，该斑点可分离出至少5个化合物（图7）。这些结果表明，目标物质可分为两个组，第一组极性中等，在中等极性的展开剂条件下能达到理想的分离效果（图7-a和图7-b）；而第二组极性较低，在中等极性的展开剂条件下大多数物质集中在展开剂的最前沿（图7-a和图 7-b），而在弱极性展开剂条件下分离为5个斑点（图7-c和图7-d）。此外，试验将TLC板置于366 nm的紫外光下进一步观察，发现各物质呈现不同颜色的荧光，如绿、蓝、黄等（图7）。这些显色特性与吲哚生物碱有共同特点[15]。

2.5 发酵产物HPLC分析

图6 不同添加物对冠突散囊菌吲哚生物合成的影响Fig. 6 Effect of different additives on the biosynthesis of indole alkaloids

图7 发酵产物TLC分析Fig. 7 TLC analysis of fermentation products of Eurotium cristatum

采用 HPLC对冠突散囊菌次生代谢产物进行了分析，结果表明（图8-a），在290 nm的紫外波长下，可以检测到10个以上明显的色谱峰，根据极性分布分为两段，第一段为中等极性类物质，各物质分离效果较好，而第二段各物质保留时间较长，且各物质分离效果不理想，说明冠突散囊菌产生的次生代谢产物有些结构和性质非常接近，有一些可能为同分异构体。对这10个比较明显的色谱峰进行了紫外吸收特征峰分析，结果如图8-b所示，所有物质呈现2个紫外特征吸收峰，分别在222、290 nm处附近，这些吸收特征与文献报道[15-16]的基本一致，说明该类化合物为吲哚生物碱类化合物。

图8 发酵产物的HPLC分析(a)和紫外吸收光谱分析（b）Fig. 8 HPLC (a) and UV spectrum (b) analysis of fermentation products from Eurotium cristatum

2.6 发酵产物LC-MS分析

在以上分析的基础之上，我们采用LC-MS深入分析了冠突散囊菌的发酵产物，结果如图9所示，共检测到10种吲哚生物碱类化合物，如 C19H21N3O3、C29H39N3O2、C25H27N3O3、 C44H41N3O3、 C43H46N6O4、C17H21N3O2、 C16H28N4O4、 C17H23N3O2、C22H24N4O2、C38H41N3O5等，其中C19H21N3O3为cristatumin A[15]，其余均为neoechinulin A（C19H21N3O2）的衍生物或者二聚体衍生物。

3 结论与讨论

本研究系统分析了茯茶冠突散囊菌的液体发酵产物，结果表明，茯茶冠突散囊菌能生产至少10种吲哚生物碱类化合物，与Du等[15]和 Zou等[16]研究团队的结果类似，即均在冠突散囊菌发酵产物中发现了多种吲哚生物碱类化合物。但是，笔者从茯茶冠突散囊菌获得的吲哚生物碱的组成与Du和Zou等研究团队报道的不同，从中笔者只发现了cristatumin A，其余均为neoechinulin A的衍生物或者二聚体衍生物，这可能是不同的菌株或者不同的培养条件造成的。同样，Du等[15]和Zou等[16]从冠突散囊菌中也分离到了多个不一样的吲哚生物碱类。由此也说明了，茯茶冠突散囊菌代谢产物非常丰富且具有多样性，而且对环境条件比较敏感，不同培养条件能生产不同结构的化合物。

在紫外光下，发酵产物呈现出了绿、蓝、黄等不同颜色的荧光（图7），且在222、290 nm处附近有2个明显的紫外特征吸收峰（图8-b），与文献报道的吲哚生物碱类化合物特性基本一致[15-16]，说明该类化合物为吲哚生物碱类化合物。TLC（图 7）和 HPLC（图 8）结果均表明，冠突散囊菌生产的吲哚生物碱可分为中等极性和弱极性两类，弱极性吲哚生物碱分离效果不理想，说明这类物质结构非常相似，可能共有相同的基本骨架，只存在某些基团的变化，且烷基化程度比较高。LC-MS分析结果表明（图9），所有考察的目标物质分子均含有N3O2的组成，而N3O3和N3O5的存在说明在N3O2的骨架上出现了含O基团的取代，N6O4的出现说明两个N3O2的骨架形成了二聚体。同时，从LC-MS中分子离子峰（图9）图谱可以看出，目标物质的基本单元为C13H11N3O2。综合上述定性分析以及文献报道[15-16]，可以推测茯茶冠突散囊菌代谢产物最基本的分子结构为如下吲哚生物碱（图 10），但是要准确确定各取代基团需要更多的结构鉴定数据。

图9 LC-MS质谱图Fig. 9 Mass spectrum of LC-MS

图10 推测的茯茶冠突散囊菌代谢产物分子结构Fig. 10 Proposed molecular structure of secondary metabolites from Eurotium cristatum

吲哚生物碱类化合物具有抗菌、抗过敏、抗辐射、抗紫外和抗肿瘤等多种生物活性[6-8]，研究表明，茯茶冠突散囊菌是吲哚生物碱类化合物重要生产者，具有重要的开发价值。本研究深入分析了影响冠突散囊菌繁殖速度、生长速度和次生代谢的各种因素，确定了冠突散囊菌发酵生产吲哚生物碱的最佳工艺参数。同时本研究发现，鲜茶干粉、鲜茶提取物、茯茶粉、茯茶提取物和色氨酸等均能明显提高冠突散囊菌中吲哚生物碱的含量，而其中色氨酸的效果最显著。添加物诱导吲哚碱生物碱生物合成并提高其产量的原因，可能是因为色氨酸是吲哚碱生物碱的生物合成前体物质[21]，色氨酸首先参与吲哚的生物合成，促使吲哚的产量提高，从而进一步提高了吲哚碱生物碱的产量。考察的5种添加物中均含有不等量的色氨酸，冠突散囊菌可能通过摄取添加物中的色氨酸从而提高吲哚碱生物碱的产量。而在考察的几种添加物中，纯色氨酸添加物表现出最强的诱导效应，可能说明了色氨酸是诱导冠突散囊菌吲哚碱生物碱的主要物质。傅冬和等[10]研究表明，茯茶发花后总氨基酸含量急剧降低，降低幅度达 36.84%，但目前尚不明确茯茶发花过程中总氨基酸含量急剧降低的机理。本研究发现冠突散囊菌能利用茯茶提取物或者茯茶粉中的色氨酸（图6），预示茯茶发花后总氨基酸量的下降可能主要是色氨酸的消耗或者由此产生的一系列的代谢反应。当然，要阐明茯茶发花后氨基酸含量急剧降低的机理需要更多的数据支撑，本论文也许提供了新的启示。

虽然Du[15]和Zou等[16]研究团队也报道了在冠突散囊菌中发现吲哚生物碱类化合物，但他们的工作主要在于对冠突散囊菌中发现吲哚生物碱类化合物的分离纯化，而本研究工作的重点是在于如何利用冠突散囊菌生产大量的吲哚生物碱，最大限度地利用茯茶冠突散囊菌资源。本研究建立了茯茶冠突散囊菌最佳的繁殖、生长与发酵条件，将吲哚碱生物碱的产量提高到 2.45 g·L-1，为利用茯茶冠突散囊菌产业化生产吲哚碱生物碱提供了技术支撑。吕嘉枥等[2]从冠突散囊菌中获得了酸式洛伐他汀和酯式洛伐他汀，而本研究未发现酸式洛伐他汀或酯式洛伐他汀的存在，可能是培养条件不同或者是菌株不一样，也有可能未被本研究用的提取溶剂（乙酸乙酯）所提取出来，下一步工作将具体分析冠突散囊菌是否能生产其他有价值的代谢产物。

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《茶叶科学》优秀论文评选结果揭晓

为进一步提高《茶叶科学》期刊质量，活跃学术气氛，鼓励作者撰写和发表更多、更好的优秀论文，在中国科协精品期刊项目的资助下，中国茶叶学会《茶叶科学》编辑部于2017年2月启动了《茶叶科学》优秀论文评选活动。经过论文评选组专家为期 6个月的初选和终选，最终综合论文学术先进性、研究领域、写作水平、成果应用前景，以及论文被引和下载指标等因素，从2012年1月1日至2016年12月31日期间发表于《茶叶科学》的391篇学术论文中评选出优秀论文20篇，其中优秀论文一等奖3篇，二等奖6篇，三等奖11篇。

Production of Bioactive Indole Alkaloids through Fermention of Eurotium cristatum from Fuzhuan Tea

LIU Liping1,2, TANG Yuwei1,2, WANG Ruoxian1, LI Zhibing1, LIU Zhonghua1,2,3, LIU Shuoqian1,2,3*

1. College of Horticulture and Hardening, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China, 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China, 3. Key Lab of Tea Science, Ministry of Education, Changsha 410128, China

Eurotium cristatum is the dominant fungi in Funzhuan tea, which produces indole alkaloids that have many important bioactivities, such as antibacterial, antiallergic, antiradiation, antiultraviolet, antitumor effects. In order to improve the production of indole alkaloids by E. cristatum, we investigated the factors affecting reproduction, growth and the fermentation of E. cristatum. The fermentation products of E. cristatum were analyzed using thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrum. The results showed that E. cristatum reproduced fast on Czapek-Dox solid medium with a large number of mature spores in 8 days, and the optimal growth conditions were obtained as following: pH 6.0, culture temperature 30℃, rotating speed 200 r·min-1and culture time 6 days. Moreover, fresh tea leaf powder, fresh tea leaf extract, Funzhuan tea powder, Funzhuan tea extract and tryptophan obviously improved the biosynthesis of indole alkaloids, with the best enhancing effect of tryptophan. Furthermore, at least 10 compounds were observed in thin-layer chromatography,most of which were identified to be indole alkaloids by high-performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrum, with a yield up to 2.45 g·L-1. The present work provided technical support for utilization of E. cristatum in Fuzhuan tea.

Eurotium cristatum, fermentation condition, indole alkaloids, component analysis