高效液相色谱法定量分析菜籽油中的苯并芘

张海龙，张 维，舒 楠，胡婷婷，朱可霞，杜 静，王信斌

（1.怀化学院生物与食品工程学院，民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418008；2.国家粮食局武汉科学研究设计院有限公司，湖北武汉 430079）

高效液相色谱法定量分析菜籽油中的苯并芘

张海龙1，张 维1，舒 楠1，胡婷婷1，朱可霞1，*杜 静1，王信斌2

（1.怀化学院生物与食品工程学院，民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418008；2.国家粮食局武汉科学研究设计院有限公司，湖北武汉 430079）

建立菜籽油中苯并芘测定的高效液相色谱方法，采用ODS反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）作为分析柱，以甲醇为流动相，流速1.0 mL/min，柱温室温，激发波长384 nm，发射波长406 nm，进样量10 μL；样品采用Cleanert BaP-3-SPE固相萃取柱处理。该方法加标回收率在87.00%～98.50%，具有准确、简便、快速的特点。

高效液相色谱法；菜籽油；苯并芘

Abstract：In order to establish the determination method of benzopyrene in rape seed by high performance liquid chromatography，the C18 reverse-phase chromatographic column（ODS） （Φ4.6 mm×250 mm，5 μm） is used as analytical column.The detection conditions are that the flow rate of mobile phase（methanol）is 1.0 mL/min，the temperature is room temperature，excitation wavelength is set at 384 nm，the emission wavelength is 406 nm，the injection volume is 10 μL.The sample is treatment by solid-phase extraction column.The recovery rate of the method is between 87.00%and 98.50%.The method has the characteristics of accurate，simple，rapid.

Key words：high performance liquid chromatography；rapeseed oil；benzopyrene

苯并芘 （Benzo（a）Pyrene，B（a）P），又名 3,4- 苯并芘，是目前已知的20多种致癌多环芳烃中最具代表性的致癌物之一。多项研究表明，苯并芘可以诱导白血病、肺癌、肝癌和乳腺癌的发生，是一种很强的内分泌干扰物、致畸剂和致突变剂[1]，可通过呼吸道、消化道、皮肤等途径被人体吸收，在人体中累积，长期食用损害人体健康，是世界公认的三大致癌物（亚硝胺、黄曲霉毒素和3,4-苯并芘） 之一[2]。由于苯并芘具有较强的亲脂特性，可通过加工、运输、贮藏等途径进入油脂食品中[3-4]。食用油中苯并芘的形成机理研究尚未取得较大进展，还不清楚在食用油中产生的原因[5-6]。

国内外关于苯并芘的检测方法主要是荧光分析法、高效液相色谱法、联用技术、免疫学检测法[7]等。食用油中苯并芘检测主要采用高效液相色谱法，其分为样品的预处理和检测2个基本过程。由于食用油中苯并芘具有较强的亲油性，含量少、稳定差、易吸附，且分析的样品成分复杂，存在多种潜在干扰物质，如大量甘油三酯、脂肪物质，直接影响其测定[8]。目前，我国检测植物油中苯并芘的国标（GB/T 22509—2008） 存在样品处理复杂、耗时长、试剂耗费量大、对试剂和人员要求高等问题。所以，如何建立一种准确、简便、快速、经济检测出食用油中的苯并芘含量方法，成为定量、定性分析工作的重点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜籽油，购于怀化市河西粮油市场；正己烷（分析纯）、四氢呋喃（分析纯）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），均由天津市科密欧试剂有限公司提供；苯并芘萃取柱Cleanert BaP-3-SPE，天津博纳艾杰尔科技有限公司提供；苯并芘标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

LC-20A型岛津高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；氮吹仪，上海皓庄仪器有限公司产品；Luna C18（2） 型（4.6 mm×250 mm，5 μm） 分析柱，美国pheno-menex公司产品。

2 试验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Luna C18（2） 型（4.6 mm×250 mm，5 μm） 带保护柱；流速1.0 mL/min；柱温25℃；流动相：甲醇；进样量10 μL；激发波长384 nm，发射波长406 nm。

2.2 标准品溶液的配制

准确称取10 mg苯并芘标准品用正己烷溶解定容于100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的母液置于冰箱贮藏，取一定体积的母液用乙腈分别稀释成 20.000，10.000，5.000，2.500，1.250，0.625 ng/mL的标准品溶液。

2.3 样品处理

准确称取0.500 0 g的菜籽油样，用正己烷混匀定容至5 mL，漩涡混合1 min，加入到预先活化（先用5 mL二氯甲烷，再用5 mL正己烷活化柱子）的苯并芘萃取柱中，用8 mL正己烷洗脱柱子，弃去洗脱液；再用8 mL二氯甲烷洗脱并收集洗脱液于玻璃管中，用吹氮仪吹干，准确称取1 mL甲醇漩涡混合1 min，过0.45 μm的滤膜，滤液供测试。

2.4 标准曲线的绘制

将配制好的苯并芘标准品溶液参照2.1中的色谱条件进样，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准品曲线。

2.5 准确度与精密度评价

加入适量的苯并芘标准品于油样中，超声混匀，按2.3样品处理方法进行回收率和精密度测试，通过测定加标回收率对方法准确度进行评价，根据实验结果的相对偏差对方法精密度与重现性进行评价。

3 结果与讨论

3.1 标准品和样品溶剂的选择

考查对苯并芘有较大溶解度的正己烷、甲苯、乙酸乙酯有机溶剂，参照2.1中的色谱条件，分别进样，发现甲苯、乙酸乙酯在出峰时间6.45 min左右时，具有较大响应值，峰面积较大，所以选择正己烷作为溶解标准品苯并芘和样品的溶剂。

甲苯液相色谱见图1，乙酸乙酯液相色谱见图2。

图1 甲苯液相色谱

图2 乙酸乙酯液相色谱

3.2 液相色谱条件的确定

试验比较了甲醇-水体系作流动相时苯并芘的反相色谱行为，结果表明，甲醇体积分数为100%时，表现出更佳的稳定性和重现性，柱压更低、安全性好。所以，试验采用甲醇作流动相，苯并芘进行了等度洗脱分析。

苯并芘标准品液相色谱见图3，样品液相色谱见图4。

图3 苯并芘标准品液相色谱

图4 样品液相色谱

由图4可以看出，在该洗脱条件下，苯并芘保留时间约为6.4 min，峰形对称，柱效较高，既保证了定性定量的准确性，又同时兼顾了分析效率的要求。

3.3 定量标准曲线的统计结果

参照2.1中的色谱条件对系列不同质量浓度苯并芘标准品溶液进样分析，分别以标准系列溶液的峰面积为纵坐标、标准系列溶液的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为Y=79 394X+18 244，相关系数R2=0.999，苯并芘的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，该方法的检出限为0.625 ng/mL。

3.4 方法的准确度与精密度

称取适量食用油，加入适量苯并芘标准品，参照2.3中的方法处理，进行回收率试验，测得不同苯并芘标准品添加量的回收率和相对偏差。

方法的准确度与精密度评价见表1。

表1 方法的准确度与精密度评价

由表1可以看出，加标样品回收率在87.00%～98.50%，平均回收率为95.21%；9次重复测定的相对偏差在6.78%～0.10%。由此可见，试验确定测定菜籽油中苯并芘含量的高效液相色谱法具有较高的准确度和精确度。

4 结论

建立反相高效液相色谱法定量测定菜籽油中苯并芘含量的方法，采用ODS反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 作为分析柱；流速1.0 mL/min；柱温室温；激发波长384 nm，发射波长406 nm；以甲醇为流动相，样品采用Cleanert BaP-3-SPE固相萃取。在该色谱分析条件下，苯并芘峰形对称，保留时间合适，杂峰和苯并芘峰分离度高。该方法简单、快速、高效，为食用油中苯并芘的定性、定量分析提供了一种重要途径。

[1]Gelhaussl， Gilado， Hwanwt， et al．Multidrug resistance protein （MRP） 4 attenuates benzo[a]pyrene－mediated DNA－adduct formation in human bron-choalveolar H358 cells[J].Toxicol Lett，2012 （9）：58－66．

[2]徐文俊.致癌物质对食物的污染及预防 [J].成都大学学报（自然科学版），1999，18（2）：40－44.

[3]李进伟，王兴国，金青哲．食用油中苯并（a） 芘的来源、检测和控制 [J].中国油脂，2011，36（6）：7－11.

[4]段小丽，魏复盛.苯并（a）芘的环境污染、健康危害及研究热点问题 [J].世界科技研究与发展，2002，24（1）：11－17.

[5]Cejpek K， Hajsova J， Kocourek V， et al．Changes in PAH levels during production of rapeseed oil[J].Food Addit Contam，1998，15（5）：563－574.

[6]刘国艳，张振芳，王兴国，等.食用植物油中苯并 (a)芘来源及形成机理的研究进展 [J].中国油脂，2013，38 （4）：53－59.

[7]邓安平.酶联免疫吸附分析法测定苯并（a）芘和多氯联苯 [J].环境化学，2006，25 （3）：340－343.

[8]石全英，刘香军，杜雅荣.大豆油中苯并（a） 芘检测方法的优化研究 [J].绿色科技，2015（6）：266-270.◇

Quantitative Determination of Benzopyrene in Rapeseed Oil by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Hailong1，ZHANG Wei1，SHU Nan1，HU Tingting1，ZHU Kexia1，*DU Jing1，WANG Xinbin2
（1.Key Laboratory of Hu'nan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources，College of Biological and Food Engineering，Huaihua University，Huaihua，Hu'nan 418008，China；2.Wuhan Science Research&Design Institute，State Administration of Grain，Wuhan，Hubei 430079，China）

TS229

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.034

1671-9646（2017） 09b-0026-03

2017-07-23

2016年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目（201610548009）。

张海龙（1985— ），男，硕士，讲师，研究方向为油料副产品加工与利用。

*通讯作者：杜 静（1989— ），女，硕士，讲师，研究方向为油作物副产物的应用。