酶法降解米糠中植酸的工艺研究

2017-10-16胡彬柴程战虎

食品研究与开发 2017年20期

关键词：肌醇植酸酶植酸

胡彬，柴程，战虎

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

酶法降解米糠中植酸的工艺研究

胡彬，柴程，战虎

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

通过酶法降解米糠中植酸，植酸酶能将植酸及其二价盐类菲丁水解生成肌醇。以酶用量、酶解时间、pH值、酶解温度为影响因素，以代谢产物肌醇含量为判定依据进行单因素试验及正交试验以得出较优组合。通过试验得出四因素对植酸酶酶解植酸所得的肌醇含量的影响大小顺序为：酶用量＞pH值＞反应时间＞反应温度，植酸最佳酶解条件为酶用量60 U/g，反应时间20 min，pH值4.0，反应温度55℃。验证试验测得肌醇含量为66.21 mg。酶解法反应条件温和、耗能低，为工业化生产提供了一种新的思路。

米糠；植酸；肌醇；酶解

Abstract：Degradation of phytic acid in rice bran by enzymatic method，phytase can form phytic acid and its divalent salt phenanthroline to produce inositol.The effects of enzyme dosage，enzymolysis time，pH value and enzymolysis temperature were studied，single factor test and orthogonal test were used to determine the optimal combination of the inositol content of the metabolites.The results showed that the effect of four factors on the phytase content of phytase was enzyme dosage＞pH＞ reaction time＞ reaction temperature，the phytase optimum conditions for the amount of enzyme 60 U/g，reaction time 20 min，pH value of 4.0，reaction temperature 55℃.Verifying test the inositol content was 66.21 mg.Enzymatic hydrolysis has mild reaction conditions，low energy consumption，for the industrial production provides a new idea.

Key words：rice bran；phytic acid；inositol；enzymolysis

米糠是一种具有很高经济价值的油料资源。米糠中除米糠油、米糠蛋白外，还富含多种营养物质和功能成分。米糠中植酸及其二价盐类菲丁物质的含量可达11%左右[1]。以植酸及其二价盐类菲丁为主要底物，利用微生物产生的植酸酶和磷酸酯酶来生产肌醇[2]，是未来米糠中植酸类物质应用趋势。这是在一系列复杂的调控中非常精巧地将植酸或菲丁在酶的作用下转化为肌醇。由于酶的反应条件比较温和，此法制取肌醇可在常温常压下进行，且不会造成污染。肌醇生产企业的规模和数量，都有不断增长的趋势，这便对肌醇的生产工艺提出了新的更高的要求。目前研究热点是微生物酶解法和化学合成法[3]，化学合成法在国内已实现工业化生产，但酶解法在国内仍处于研究阶段，具有广阔应用前景，是今后肌醇生产发展方向[4]。本试验所采用酶解法反应条件温和、耗能低，为工业化生产提供了一种新的思路。

1 材料与设备

1.1 材料

米糠：市售；植酸酶（活力3万U/g）：天津一方科技有限公司；硫代硫酸钠溶液 [标准物质编号：GBW（E）081235；批号：160613]、重铬酸钾标准溶液[标准物质编号：GBW（E）080497；批号：160601]：上海市计量测试技术研究院；其它化学试剂均为分析纯：天津一方科技有限公司。

1.2 设备

XMTD-204数显式电热恒温水浴锅：天津欧诺仪器仪表有限公司；DHG-电热恒温鼓风干燥箱：巩义市予华仪器有限责任公司；PHS-3C数字PH计：天津市盛邦科学仪器技术公司；T-500型电子天平：常熟双杰测试仪器厂；720分光光度计：上海亚荣生化仪器厂；DF-101S恒温磁力搅拌器：巩义市英峪予华仪器厂。

2 方法

2.1 米糠植酸溶液的制备

准确称取100 g米糠于烧杯中，以米糠∶水（质量比）=1∶8的比例加水，用盐酸调pH值为3.0，在28℃下搅拌浸泡6 h后进行离心分离（2 000 r/min，15 min），抽滤，将离心后残渣用清水洗涤再次抽滤，两次滤液合并得到植酸提取液，经717型阴离子交换树脂除杂得到植酸钠洗提液，定容至500 mL，为米糠植酸溶液。经测得，该溶液中植酸含量为0.008 6 g/mL。

2.2 酶解试验

取植酸稀溶液于50 mL烧杯中，加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，调节反应底物植酸的pH值，然后加入植酸酶溶液，水浴加热，水解一定时间后测量水解液中肌醇含量。以肌醇含量为指标探究加酶量、时间、pH、温度等因素对植酸酶酶解的影响。

2.3 肌醇含量的测定方法[5]

肌醇为环已六醇，在强酸性溶液中，用重铬酸钾氧化生成二氧化碳和水，其反应如下：

使用过量的重铬酸钾标准液氧化滤液中的肌醇，过量的重铬酸钾氧化碘化钾。使碘离子游离生成游离碘，然后用硫代硫酸钠标准溶液滴定。其反应如下：

酶解完成后，立即取出并放入煮沸的沸水中，使酶失活。冷却至室温后，抽滤，除去不溶物，收集滤液。并记录滤液体积。取滤液8 mL滤液于250 mL的碘量瓶中，加入2 mL标定的重铬酸钾标准溶液，5 mL 20%的稀硫酸溶液，于80℃水浴加热3 h，冷却至室温后加入4 mL10%碘化钾溶液，水封后置于暗处反应15 min，然后加入约20 mL蒸馏水，用0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至近终点时，即溶液显黄绿色，加入0.5%淀粉溶液10滴，继续滴定至蓝色消失，记录消耗的硫代硫酸钠溶液的体积。按下式计算肌醇含量。

式中：m为肌醇含量，mg；c1为K2Cr2O7溶液浓度，mol/mL；v1为 K2Cr2O7溶液体积，mL；c2为 Na2S2O3溶液浓度，mol/mL；v2为 Na2S2O3溶液体积，mL。

2.4 单因素试验

2.4.1 酶用量对肌醇含量的影响

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量为0.008 6 g/mL）于50 mL烧杯中，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液，调节pH 值到 5.5，分别加入活性 0、30、60、90、120、150 U/g的植酸酶，在55℃水浴加热10 min，立即取出并经100℃沸水加热使酶失活，通过抽滤，除去不溶物，测定滤液中肌醇含量。

2.4.2 时间对肌醇含量的影响

取20mL植酸稀溶液（植酸含量为0.008 6 g/mL）于50 mL烧杯中，加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH值到5.5，加入30 U/g的植酸酶，55℃水浴加热分别加热 5、10、15、20、25、30 min，立即取出并经 100 ℃沸水加热使酶失活，通过抽滤，除去不溶物，测定滤液中肌醇含量。

2.4.3 pH值对肌醇含量的影响

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量为0.008 6 g/mL）于50 mL烧杯中，加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，调节 pH 值到 2、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.5、6、6.5，加入 30 U/g的植酸酶，55℃水浴加热分别加热25 min，立即取出并经100℃沸水加热使酶失活，通过抽滤，除去不溶物，测定滤液中肌醇含量。

2.4.4 温度对肌醇含量的影响

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量为0.008 6 g/mL）于50 mL烧杯中，加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH值到5.5，加入30 U/g的植酸酶，分别在35、45、55、65、75℃下水浴加热25 min，立即取出并经100℃沸水加热使酶失活，通过抽滤，除去不溶物，测定滤液中肌醇含量。

2.5 正交试验设计

在单因素研究的水平上，设计了以酶用量、时间、pH值、温度为自变量，以所得的肌醇含量作为四因素三水平的正交试验。正交因素水平如表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Factor and levels of orthogonal experiment

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 酶用量对肌醇含量的影响

酶用量对肌醇含量的影响见图1。

图1 酶用量对肌醇含量的影响Fig.1 Effect of the amount of enzyme on inositol

由图1可以看出，当酶用量小于60 U/g时，肌醇含量随着酶用量的增加而增加。但是当酶用量大于60 U/g之后，肌醇含量增加不明显。可能是因为酶用量达到60 U/g时反应已经达到平衡，继续增加酶用量，并不能促进酶解反应的进行。而且酶用量的增加，会促使产品成本的增加。因此，选择酶用量为60 U/g最宜。

3.1.2 时间对肌醇含量的影响

时间对肌醇含量的影响见图2。

图2 时间对肌醇含量的影响Fig.2 Effect of time on inositol

由图2可以看出，当酶解时间小于25 min时，肌醇含量随着酶解时间的增加而增加，但是当酶解时间大于25 min时，肌醇含量趋于平衡，不但没有增加，反而有减小的趋势。可能降解25 min后，反应已达到平衡，增加酶解时间并不能促进反应的进行。增加酶解时间必然会增加产品的成本，本试验采取的酶解时间为25 min。但是由于时间拐点并不明显，因此在今后的试验中应继续延长时间，再测定肌醇含量。

3.1.3 pH值对肌醇含量的影响

pH值对肌醇含量的影响见图3。

由图3可以看出，当pH值大于2.5时，肌醇含量随pH值的升高而升高，但肌醇含量小于pH值为5.5时的肌醇含量。当pH值小于5.5时，肌醇含量随着pH值得升高而逐渐升高，当pH值大于5.5时，肌醇含量随着pH值得升高而减少。主要是因为pH值过低不能使植酸酶达到最大活性；pH值过高植酸酶则可能失活，二者都不能使植酸酶最大发挥活性，致使效果不佳。因此，本试验采用的pH值为5.5。

图3 pH值对肌醇含量的影响Fig.3 Effect of pH value on inositol

3.1.4 温度对肌醇含量的影响

温度对肌醇含量的影响见图4。

图4 温度对肌醇含量的影响Fig.4 Effect of temperature on inositol

由图4可以看出，当温度小于55℃时，肌醇含量随着温度的升高而升高，但当温度大于55℃时，肌醇含量随着温度的升高而减少。主要是因为当温度较低时，植酸酶未能充分发挥其活性，酶解反应不完全，得到的肌醇含量少。当温度较高时，植酸酶活性被抑制，致使酶解效果不佳。因此，本试验采用的酶解温度为55℃。

3.2 正交试验结果及分析

本试验采用L9（34）正交试验设计，依据研究目的要求，选取酶用量、时间、pH值、温度4个因素设计试验及优化酶解工艺。试验结果及分析如表2、表3所示。

表2 正交试验结果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

续表2 正交试验结果分析Continue table 2 Analysis of orthogonal experiment results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

由正交试验中极差R得知，四因素对本试验影响大小顺序为：酶用量＞pH值＞反应时间＞反应温度。而由均值1、均值2、均值3值得出的最佳组合为A2B1C1D2。验证试验所得肌醇含量为66.21 mg，高于第6组试验结果，故选取酶用量60 U/g，反应时间20 min，pH值4.0，反应温度55℃，作为最佳媒介条件。由方差分析表可以看出，误差为10.28，是由于植酸酶品种差异造成及人为操作不当造成的。

4 结论

根据本次试验数据得出以下结论：对植酸酶酶解植酸所得的肌醇含量的影响大小顺序为：酶用量＞pH值＞反应时间＞反应温度。这4个条件对提高肌醇产量时的最佳组合即最佳条件为酶用量60 U/g，反应时间20 min，pH 4.0，反应温度55℃，经过验证试验得出肌醇含量达66.21 mg。目前，肌醇的生产方法主要是通过化学方法完成的，这些方法的最大缺点是能耗较高、污染较大、剩余的废渣不能综合利用，这与化学工业的发展趋势相背离。现代化学工业的发展趋势是环境友好、绿色化学、可持续发展，要求生产体系在赢得经济利益的同时，不对环境构成威胁；尽可能少地消耗不可再生的资源；还要降低或消除有有害物质的使用和生成的化学产品和制造工艺。

生物催化为实现绿色化学的目标提供了许多优势：新型、高效率、周期短、选择性提高、常温、常压。多数生物催化剂对人类和环境不构成危害，通过避免使用高温、高压、避免金属和有机溶剂的大量消耗，将大大降低单位产品的废物产生量。

肌醇重要性已受到人们普遍关注，它的制取方法也日益成熟和多样化。但目前肌醇传统制取方法还存在有制约肌醇生产不利因素；生物工程技术生产肌醇也有待进一步完善和成熟；肌醇在某些方面作用机理和应用安全性还存在争议，尚待进一步研究。我国有丰富脱脂米糠、鼓皮等肌醇资源可供开发，且随着研究不断深入，人们对肌醇需求量将会越来越大，尤其是以肌醇为原料的保健食品、功能饮料和含有肌醇减压降脂药品，具有很大市场发展潜力[6-10]。

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Process of Enzymatic Degradation of Phytic Acid in Rice Bran

HU Bin，CHAI Cheng，ZHAN Hu
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）