食源性糖蛋白分离纯化的研究进展

赵文竹，张宏玲，陈月皎，于志鹏，*，张瑞雪，刘静波，励建荣，*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013；2.吉林大学营养与功能食品研究室，吉林长春130062）

食源性糖蛋白分离纯化的研究进展

赵文竹1，张宏玲1，陈月皎1，于志鹏1，*，张瑞雪1，刘静波2，励建荣1，*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013；2.吉林大学营养与功能食品研究室，吉林长春130062）

糖蛋白是由寡糖链与蛋白质共价相连构成的复合糖，具有多种生物活性，糖蛋白的分离纯化与糖蛋白结构解析和功能分析的研究有着密不可分的关系。对糖蛋白的分离纯化方法进行综述，并对未来糖蛋白的分离纯化进行展望，旨在探索糖蛋白的高效分离纯化方法，为糖蛋白的深入研究提供理论依据。

糖蛋白；分离；纯化；结构鉴定

Abstract：Glycoprotein is a glycoconjugate in which a protein carries one or more carbohydrate chains covalently attached to its polypeptide backbone.Glycoprotein has emerged as an important class of bioactive natural products extracted from natural resources.The purification of glycoprotein has intimate relation with the research of glycoprotein structure and function analysis.Reviewing the methods of purification of glycoprotein，in addition，the further study of purification of glycoprotein was addressed to find a novel approach for purification of glycoprotein，aiming to provide a theory basis for furthering research of glycoprotein.

Key words：glycoprotein；separation；purification；identification

糖蛋白是一种结合蛋白，是寡糖链与多肽以多种形式共价相连且具有生物活性的物质，兼具多糖和蛋白质的功能性质。糖蛋白是蛋白质翻译后修饰的产物，蛋白质的许多生理功能均可以通过糖基化来实现[1]。糖蛋白具有抗氧化[2]，抗老年痴呆[3]，抗炎症[4]，免疫调节[5]等生物活性，生物活性与糖链有着密不可分的关系，如糖脂糖链对血型、大脑及神经组织的生命活动有决定作用[6]。糖链结构对于糖蛋白功能活性有着直接的影响，高纯度的糖基化蛋白是结构解析的首要步骤，因此，糖蛋白的分离纯化是结构分析和功能性分析的前提基础[1]。糖蛋白的纯化是指除去粗糖蛋白中的杂质，获得单一糖蛋白组分的过程，对于糖蛋白的分离纯化主要是参考蛋白质和多糖的分离纯化方法[7]，由于其糖链结构的复杂性和多样性，糖蛋白的分离纯化在一定程度上增加了难度，因此纯化的方法尤为重要。本文对目前常用的糖蛋白分离纯化方法进行介绍。

1 色谱法

色谱法是糖蛋白分离纯化研究中一种常用手段，其应用已较为成熟[8-17]，主要为离子交换色谱法、凝胶色谱法和凝集素亲和色谱法。

1.1 离子交换色谱法

离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，通过固定相上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换而达到分离的目的，主要用于分离离子或可解离化合物[18]。Braga等[19]将掌叶苹婆种子纯化组分用0.025 mol/L Tris-HCL缓冲液洗脱，将500 μL样品装样到离子交换柱上进行纯化，对纯化后的凝集素进行检测，其分子量为17 kDa，并对热和酸稳定，且有抗氧化活性、抗菌活性和低溶血性。Wang等[20]用DEAE-52 celloulus阴离子交换柱层析对大蒜糖蛋白进行纯化，用苯酚-硫酸法、凝胶渗透色谱法和SDS-PAGE电泳法对糖蛋白组分进行检测，证明糖蛋白是同一种糖蛋白且组分纯度较高。Senthilkumar等[21]通过Q-Sepharose阴离子交换柱层析对绿色海藻进行纯化，用考马斯亮蓝染色（CBB）和碘酸雪夫氏染色（PAS）对SDS-PAGE电泳进行染色，对纯化得到的糖蛋白的化学成分、等电点、构象、蛋白质类型、抗癌活性进行分析，表明经纯化得到了一种新型的糖蛋白。

1.2 凝胶色谱法

凝胶色谱的分离机理类似于分子筛效应，按照分子尺寸与凝胶孔径大小之间的相对关系来进行分离，溶质流出凝胶的速率取决于分子的大小和凝胶的阻碍作用。Su等[22]对黄海马糖蛋白（HG）进行纯化，将经过DEAE-52阴离子交换柱层析纯化得到的两个组分HG-1和HG-2，用Sephadex G-100凝胶柱层析进行进一步纯化，进一步纯化后的HG-1和HG-2组分分别在20 min～115 min和15 min～75 min检测发现为均一的糖蛋白组分，且糖含量分别为56.7975%和39.479%，蛋白质含量分别为30.547 5%和51.747%。Dai等[23]对虎斑乌贼肌肉糖蛋白（SPMG）进行纯化，经DEAE-52阴离子交换柱层析纯化得到了两个组分SPMG-A和SPMG-B，SPMG-A组分糖蛋白含量较少且难收集，将SPMG-B组分作为主要的研究对象，用Sephadex G-100凝胶柱层析对SPMG-B进行进一步的纯化，得到两个均一的糖蛋白组分SPMG-Ⅰ和SPMG-Ⅱ。Yang等[24]对银杏核糖蛋白进行纯化，将经过DEAE-52阴离子交换柱层析纯化后分析得到的Ⅰ组分进行Sephadex G-200凝胶柱层析纯化，分析发现凝胶柱层析后的5组分是均一的银杏核糖蛋白组分。

1.3 凝集素亲和层析

凝集素亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力来进行纯化的技术。对于一些如酶、蛋白、抗体、核酸等生物大分子和带电性质相似，分子大小相近的糖链，亲和色谱的选择性最高。凝集素是一类蛋白质或是糖蛋白[1]，由于凝集素能识别、结合特定单糖或糖链结构的糖蛋白，因而凝集素亲和层析是分离纯化糖蛋白时最有效的工具[25]。常用的凝集素有伴刀豆凝集素（ConA）和麦胚凝集素（WGA）等，ConA能特异结合α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基。不同糖蛋白的伴刀豆凝集素（ConA）和麦胚凝集素（WGA）的结合部位与杂环硼酸酯的反应流程如图1所示[26]，ConA能特异结合在C3、C4和C6有自由羟基的糖蛋白的甘露糖和葡萄糖残基上，硼酸共价结合甘露糖、半乳糖和葡萄糖，WGA能结合含有末端N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸或者壳二糖的低聚糖。

图1 不同N-糖链结构的凝集素结合部位与杂环硼酸酯的反应Fig.1 The binding motifs for the lectins of different N-glycan structures and the reaction scheme for the formation of the heterocyclic boronic acid diester

王艳等[27]在分离纯化玉竹糖蛋白时，通过ConA亲和层析，将经Sephadex G-100凝胶过滤的粗糖蛋白进一步纯化，得到两种糖蛋白PDG1和PDG3，其分子量分别为186 kD和28.3 kD，且具有一定抗氧化能力。Jana等[28]利用ConA亲和层析分离纯化出核糖核酸酶B及辣根过氧化物酶，用MALDI-MS对含有0.2 mol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷溶液进行洗脱的洗脱液和洗涤液进行测定，结果证明糖蛋白纯化效果很好。Lee等[29]用Con A-Sepharose 4B分离纯化栀子花糖蛋白并进行洗脱，得到分子量为27 kDa的糖蛋白。

2 膜分离法

膜分离作为一种新型的分离技术，具有收率高、耗能低的特点，还极少破坏被纯化物质的生物活性，适用于热敏性物质（多糖、蛋白质等）等活性物质的分离纯化[30]，包括超滤、纳滤等[31]。膜分离法在蛋白质分离纯化中的应用较多，对于糖蛋白的分离纯化应用的还较少，膜分离法是根据膜的孔径大小对不同分子量物质进行截留，但只能达到粗略地对糖蛋白进行分级的目的，要想进一步纯化，还要结合色谱法或者电泳法。刘栋[32]在制备甘薯糖蛋白的过程中，将膜分离技术与Sephadex G-150结合使用，分离纯化得到了两种组分，并且具有抗突变和抗肿瘤活性。

超滤是利用膜的选择性，将膜两侧的压力差作为推动力，根据溶液中各个组分与孔径大小之间的关系，导致通过膜的迁移速率不同，进而实现分级分离[33-34]。超滤技术具有不会发生相变、耗能低、在常温下可操作等特点。使用超滤对产品进行纯化，提高纯度的同时，还可节约试剂的使用量，且由于分离纯化的连续性，可以缩短生产的周期。任国艳等[35]采用多步分离纯化，通过超滤浓缩、分级沉淀、阴离子交换柱层析和凝胶柱层析对海蜇头糖蛋白分离纯化后，得到组成均一的JGP-Ⅲ糖蛋白，其中既有O-糖肽键，又有N-糖肽键。

纳滤与超滤相同，是利用膜两侧的能量差作为推动力，根据组分与孔径大小间的关系实现分级分离[30，33]。纳滤是介于反渗透和超滤之间的一种压力驱动型膜分离技术，纳滤膜的截留分子量为150 u～1 000 u[30]。纳滤技术不需加热，不发生相变，没有化学反应的发生，不破坏生物活性，不改变风味，节能，分离效率高，污染小，被广泛地应用于食品中的分离纯化等过程[30]。

透析是利用小分子经过半透膜扩散到水溶液的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术，透析常用于除去小分子物质。范勇等[36]将Sephadex G-100凝胶过滤柱层析和DEAE-52纤维素柱层析分离纯化得到的两种巨大型蒲公英糖蛋白组分，用透析法纯化得到巨大型蒲公英小分子量糖蛋白。

3 电泳法

电泳是利用分子大小、形状、负载电荷不同的糖蛋白在电场作用下迁移速率不同而达到分离的方法。常用的分离纯化方法有凝胶电泳和毛细管电泳等。

在糖蛋白的研究中，与其它分离技术相比，凝胶电泳可以同时分离多个复杂混合物，凝胶电泳常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳常用于蛋白质的分离，无法分离大分子的糖蛋白；而琼脂糖凝胶孔径大，致使小分子糖蛋白直接透过，因此对小分子糖蛋白达不到筛选的效果或者效果不明显，主要用于分离大分子的DNA。程玉祥[37]对茶树叶糖蛋白进行了纯化研究，利用SDS-PAGE凝胶电泳和ConA-sapharose亲和层析对茶树叶糖蛋白进行纯化，对在SDS胶上快速纯化的糖蛋白用被动扩散的方式进行回收，结果表明回收率为50%。

毛细管电泳是以毛细管为分离通道、以高压电场为驱动力，依据样品中各组分带电粒子在毛细管溶液中迁移速度不同而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳具有简单、高效、快速、微量、易于自动化、一机多用和环境污染少等特点，广泛应用于分离多种化合物。陈义[38]以聚丙烯酰胺涂层毛细管为分离通道对鸡卵白蛋白分离出25个以上的峰，使转铁蛋白分离出10个左右的峰。目前，电泳多用于分离后的纯度鉴定和分子量的确定。

4 展望

目前，糖蛋白分离纯化的方法大多是沿用蛋白质的方法，对于糖蛋白的分离纯化应用较多且较为成熟的还是凝胶色谱法和离子交换色谱法，凝集素亲和色谱也时常用到。由于糖蛋白具有微观不均一性，结构复杂多样，致其测定较为困难，糖蛋白的分离纯化与糖蛋白的结构有着密不可分的关系，找到更好的分离纯化糖蛋白的方法对于糖蛋白结构的分析也有一定的帮助。糖蛋白的复杂性，可能致使使用单一的纯化方法，不能达到理想的纯化效果，在未来糖蛋白的分离纯化中，可以从以下几方面进行：一是沿用现有较为成熟的色谱法之外，将目前的方法相结合，如将膜分离法与电泳法等结合使用；二是将更多分离纯化蛋白质或多糖的方法应用在糖蛋白中，与分离纯化糖蛋白的成熟方法相比较，以期找到更有效的分离纯化方法，为糖蛋白的分离纯化提供新思路，也为糖蛋白的进一步研究提供良好的基础。

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Progress on the Purification of the Food-derived Glycoproteins

ZHAO Wen-zhu1，ZHANG Hong-ling1，CHEN Yue-jiao1，YU Zhi-peng1，*，ZHANG Rui-xue1，LIU Jing-bo2，LI Jian-rong1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

2017-02-25

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.040

国家自然科学基金项目（31601479）；渤海大学博士启动项目（0515bs020）

赵文竹（1986—），女（汉），讲师，博士，研究方向：植物活性成分研究。

*通信作者：于志鹏（1984—），男，讲师，博士，研究方向：蛋白质及活性肽；励建荣（1964—），男，教授，博士，研究方向：水产品加工。