链格孢侵染对甜瓜病程相关蛋白活性及基因表达的影响

2017-10-16,,,,

食品工业科技 2017年18期

关键词：伽师链格几丁质

, , ,,

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

链格孢侵染对甜瓜病程相关蛋白活性及基因表达的影响

张培岭,黄伟,马玲,冯作山,白羽嘉*

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052)

以抗病能力强的伽师瓜和抗病能力较弱的86-1甜瓜作为实验材料,研究甜瓜果实应答链格孢侵染过程中对几丁质酶(CHT)、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活力变化的影响及基因表达规律。伽师瓜和86-1甜瓜接种浓度为1×106个/mLA.alternata孢子悬浮液20 μL,置于6～8 ℃冷库贮藏,测定病斑大小,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力及基因相对表达量。结果表明:损伤接种A.alternata后,伽师瓜和86-1甜瓜均在15 d发病,贮藏过程中伽师瓜果实的发病率及病斑大小均低于86-1甜瓜;甜瓜应答侵染过程中,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力呈现先升高后下降的趋势,分别于21 d,18 d达到酶活高峰,且接种伽师瓜酶活力显著高于86-1甜瓜(p<0.05),伽师瓜通过增强病程相关酶活力来抵御链格孢的侵染;伽师瓜CHT1、CHT2、GLU基因表达量显著高于86-1甜瓜,分别在贮藏18、18、15 d表达量最大;贮藏0～21 d病程相关蛋白活力及基因相对表达量与病斑直径呈正相关,说明病程相关蛋白在植物抵御病原微生物侵染早期与中期中起到了关键作用,并且在侵染中期作用显著。

甜瓜,链格孢,病程相关蛋白,基因表达

Abstract:Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon species with the characteristics of disease resistance were used as experiment material. This study was aimed to the activities of CHT,GLU and the gene expression rules for CHT and GLU in muskmelon fruits inoculated withA.alternatawere analyzed. Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon were inoculated with 20 μLA.alternataspore suspension,inoculation with 20 μL of sterile water as a blank control,the materials were transferred to cold storage at 6～8 ℃,determination of lesion size,the activities of CHT,GLU and the gene expression ofCHTandGLU. The results showed that the incidence and the lesion size of Jiashi muskmelon were lower than that of 86-1 muskmelon during the inoculated withA.alternataafter 15 days. During the infection period,the activities of CHT,GLU was significantly increased with a trend from rise to decline. The peak of activities for CHT,GLU revealed of 21 d,18 d. The activities of CHT,GLU in Jiashi melon significantly higher than 86-1 muskmelon Jiashi muskmelon to resist the infection ofA.alternariaby enhancing the activity of protease and maintaining the enzyme activity at a higher level. The relative expressions forCHT1,CHT2,GLUwere higher in Jiashi muskmelon than 86-1 muskmelon during the whole infection period. The expression levels ofCHT1,CHT2 andGLUwere significantly higher than 86-1 melon,and the expression level ofCHT1,CHT2 andGLUwas the highest in storage at 18,18 and 15 days. The relative expression of protein-related protein and gene expression were positively correlated with lesion diameter for 0～21 d. These results suggest that the pathogenesis related proteins play a key role in the early and middle stage of plant pathogen resistance.

Keywords:muskmelon;Alternariaalternata;pathogenesis-related proteins;gene expression

甜瓜在田间种植、采后运输过程中始终遭受到病原微生物的持续侵染,因此甜瓜内源性抵御病原菌侵染的能力是关键。果实采后病程相关蛋白的研究可从抗病防卫基因调控及其所编码的蛋白生物活性等方面揭示果实采后抗病性的机制[1]。病程相关蛋白的诱导主要通过病原侵染、生理因素、化学诱导剂、物理因素产生[2],病程相关蛋白可以直接对病原菌起到抵御的作用。研究发现在诱导产生SAR的植物体中没有受到侵染的部位几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性也显著升高[3-4]。目前,果实采后病程相关蛋白的研究主要集中于苹果、芒果、番茄、葡萄[5-8]等,对伽师瓜病程相关蛋白的研究报道较少。

本实验将接种链格孢后的伽师瓜和86-1甜瓜置于低温条件贮藏(6～8 ℃),研究链格孢侵染对甜瓜果实几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活力及其基因相对表达的影响。了解甜瓜采后抗病害的内在机制,为甜瓜采后贮运保鲜提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

伽师瓜、86-1甜瓜采自新疆喀什地区伽师县,选取果实大小均匀、成熟度一致,无病虫害,无机械损伤的果实;链格孢(Alternariaalternata) 分离自‘卡拉克塞’伽师瓜和86-1甜瓜自然发病的果实,PDA保存待用;焦碳酸二乙酯(DEPC) BBilfe Sciences公司;琼脂糖、50×TAE 生工生物工程(上海);Marke.r DL2000 北京天根生化科技有限公司;上样缓冲液、植物cDNA反转录试剂盒北京全式金生物技术有限公司。

DNP-9272型电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司;MM-2型微量振荡器金坛市医疗仪器厂;Nefuqe 15R高速冷冻离心机上海力申科学仪器有限公司;XH-C型漩涡混合器金坛市良友仪器有限公司;K5500核酸蛋白定量仪北京凯奥科技发展有限公司;DYY-6C型电泳仪、DYCZ-21电泳槽北京市六一仪器厂;Tanon2500凝胶成像系统上海天能。

1.2 实验方法

1.2.1 孢子悬浮液的配制收集25 ℃培养7 d链格孢孢子,用含有0.05% Tween-20的无菌水配制孢子悬浮液,使悬浮液中A.alternata孢子的浓度为1×106个/mL[9]。

1.2.2 损伤接种链格孢孢子悬浮液伽师瓜、86-1甜瓜表面用30%双氧水清洗消毒晾干。接种部位用75%酒精擦洗进行消毒,在甜瓜果实赤道等距离刺孔6个,深度3 mm,接种20 μL的孢子悬浮液。接种完成后,于6～8 ℃、相对湿度85%～90%的冷库贮藏。对照组甜瓜接种等量无菌水。

1.2.3 取样方法分别于处理后0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d 取病斑周围3～10 mm处果肉组织,液氮速冻,-80 ℃保存。

1.2.4 甜瓜果实病斑直径的测量利用十字交叉法测定果实病斑直径[10]。

1.2.5 甜瓜几丁质酶(CHT)活力的测定参照曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》方法[11]。

1.2.6 甜瓜β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活力的测定参照曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》方法[11]。

1.2.7 甜瓜RNA提取和检测采用TRIZOL法提取不同时间点甜瓜总RNA,利用RNase-free DNase试剂盒去除DNA后经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RNA完整性,并利用核酸蛋白定量仪对所提取的RNA的OD260/280、OD260/230和浓度进行测定,然后将提取的RNA分装后存放于-80 ℃超低温冰箱中待用。

1.2.8 RNA反转录采用TransScript One-Step gDNA Removal And cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒说明方法将RNA反转录合成cDNA。

1.2.9 目的基因和内参基因的克隆以两个不同品种甜瓜的总RNA逆转录得到的cDNA为模板,根据已报道伽师瓜及86-1甜瓜的CDS区序列,利用分子生物学软件Oligo 6.0进行特异性引物设计(表 1),并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物片段,连接到pMD18-T载体,连接反应体系10.0 μL,包括 Solution I 4 μL,PCR 产物 5 μL,pMD18-T 0.2 μL,H2O 0.8 μL,16 ℃连接过夜。转化感受态细胞,倒置培养过夜。挑取阳性菌落,回收产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

表1 GLU、CHT和内参基因PCR扩增特异性引物Table 1 PCR amplification primers of GLU，CHT and reference gene

1.2.10 RT-PCR的测定以反转录得到的cDNA为模板进行CHT1、CHT2、GLU和内参基因GAPDH的实时荧光定量PCR扩增。优化后的反应条件为(20 μL体系)SYBR Select Master Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL。反应程序为50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,40个循环,60 ℃ 1 min。每个样品重复三次。反应结束后以溶解曲线来判定RT-qPCR的特异性;将得到的每个样品的CT值使用2-ΔΔCT[12]法计算甜瓜不同时间内CHT1、CHT2和GLU的相对表达量。

1.2.11 数据统计与分析采用Excel 2003进行数据处理;采用Origin8.0进行图表绘制;采用SPSS 20. 0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 伽师瓜和86-1甜瓜接种链格孢后病斑直径的变化

如图1所示,伽师瓜和86-1甜瓜接种A.alternata后,贮藏15 d开始病斑直径呈不断扩大的趋势,贮藏第21 d起,伽师瓜与86-1甜瓜相比,病斑扩展相对较慢,差异显著(p<0.05)。接种链格孢的伽师瓜和86-1甜瓜均在贮藏第15 d出现病斑,贮藏第21 d开始,86-1甜瓜病斑扩散速度加快,贮藏第21 d,86-1甜瓜病斑直径较伽师瓜果实高出46.15%(p<0.05);在贮藏第27 d和30 d时伽师瓜病斑直径分别低于86-1甜瓜0.61 cm和0.37 cm。

图1 链格孢侵染对甜瓜果实病斑直径的影响Fig.1 Effects of A.alternata infection on lesion diameter of muskmelon fruit

2.2 伽师瓜和86-1甜瓜接种链格孢后几丁质酶活性的变化

如图2所示,链格孢侵染后甜瓜果实中几丁质酶活性呈现先升高后降低的变化趋势,接种后伽师瓜果实几丁质酶活性在6～12 d迅速升高，而86-1甜瓜果实在9～12 d酶活性上升快速,较伽师瓜果实有所推迟,说明伽师瓜在抵御病原微生物侵染的过程中能更早启动抗病酶,酶活性高于86-1甜瓜。在接种第21 d酶活性达到高峰,接种后伽师瓜酶活较86-1甜瓜高出6.50%(p<0.05),之后酶活性迅速下降并趋于稳定,贮藏结束时(30 d)伽师瓜酶活性为101.06 U，比86-1甜瓜高11.83%(p<0.05)。

图2 链格孢侵染对伽师瓜和86-1甜瓜几丁质酶活性的影响Fig.2 Effects of A.alternata infection on CHT activity of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon

2.3 伽师瓜和86-1甜瓜接种链格孢后β-1,3-葡聚糖酶活性的变化

如图3所示,低温贮藏过程甜瓜果实GLU活性变化趋势一致,呈先上升后下降的趋势。贮藏第18 d达到酶活高峰,接种链格孢伽师瓜果实GLU活性为1334.96 U,较接种无菌水组GLU活性高12.23%(p<0.05),链格孢侵染可显著增强伽师瓜果实抗病酶活性;86-1甜瓜果实在酶活高峰GLU活性为1275.64 U,之后酶活力迅速下降。贮藏末期,接种链格孢伽师瓜果实GLU活性为720.72 U,较86-1甜瓜高出19.55%(p<0.05),整个贮藏过程中伽师瓜GLU活性显著高于86-1甜瓜。

图3 链格孢侵染对伽师瓜和86-1甜瓜β-1,3-葡聚糖酶活性的影响Fig.3 Effects of A.alternata infection on GLU activity of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon

2.4 RNA完整性和质量检测

RNA提取凝胶电泳图如图4所示。结果表明,两个品种的接种组和对照组总RNA凝胶图条带清晰,完整,且28S条带的亮度约为18S的2倍。同时,对所提取的总RNA的质量进行检测,发现OD260/280均在2.0以上,OD260/280值均大于2.0,说明所提取RNA质量较好,可用于下一步反转录。

图4 伽师瓜和86-1甜瓜的RNA提取结果Fig.4 Results of RNA extraction of Jiashi melon and 86-1 melon

2.5 目的基因和内参基因检测及溶解曲线分析

由图5可知,PCR产物长度均为100 bp左右,符合引物设计长度。将PCR产物送至上海生工(工程)有限公司进行测序。

图5 目的基因和内参基因的PCR扩增反应凝胶电泳结果Fig.5 Results of PCR amplification reaction gel electrophoresis of CHT，GLU and GAPDH

2.6 接种链格孢后伽师瓜和86-1甜瓜几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶基因表达量的变化

2.6.1 接种链格孢后伽师瓜和86-1甜瓜的CHT1基因表达量的变化与对照组相比,接种链格孢后伽师瓜CHT1基因相对表达量在整个贮藏期内显著增加,而86-1甜瓜在接种后12 d开始与对照组存在显著差异(图6)。在接菌3 d后,伽师瓜CHT1基因相对表达量开始升高,且在整个贮藏期内一直处于相对较高的水平,伽师瓜、86-1甜瓜CHT1基因相对表达量均在贮藏第18 d达到最大值,之后表达逐渐下调。贮藏第9～21 d伽师瓜CHT1基因相对表达量约为86-1甜瓜CHT1基因相对表达量的两倍。

图6 接种链格孢后伽师瓜和86-1甜瓜CHT1基因相对表达量的变化Fig.6 Changes of CHT1 gene relative expression after inoculation of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon with Alternaria alternata

2.6.2 接种链格孢后伽师瓜和86-1甜瓜的CHT2基因表达量的变化与对照相比,接种链格孢后伽师瓜和86-1甜瓜的CHT2基因相对表达量显著增加,且伽师瓜显著高于86-1甜瓜(图7)。接种后,伽师瓜的CHT2基因的相对表达量呈先上升后下降的变化趋势。伽师瓜CHT2基因相对表达量在整个贮藏期内一直保持较高水平,接种后第6 d,基因相对表达量出现大幅上升,在接种后第18 d达到峰值,后出现缓慢下降;而86-1甜瓜的CHT2基因相对表达量呈先上升后下降再上升的波动上升趋势,在接种第18 d,CHT2基因相对表达量达到最大值。在整个贮藏过程中伽师瓜CHT2相对表达量增幅均显著高于86-1甜瓜。在接种第18 d,伽师瓜CHT2相对表达量是86-1甜瓜的2.28倍(p<0.01)。

表2 甜瓜病斑直径与病程相关蛋白酶活性和基因相对表达量的相关性分析Table 2 Correlation analysis of disease resistance index of melon with PRs activity and relative gene expression

注:*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01)。

图7 接种链格孢后伽师瓜和86-1甜瓜CHT2基因相对表达量的变化Fig.7 Changes of CHT2 gene relative expression after inoculation of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon Alternaria alternata

2.6.3 接种链格孢后伽师瓜和86-1甜瓜的GLU基因表达量的变化GLU基因相对表达量在整个贮藏过程中呈现先升高后下降的变化趋势(图8),与对照组相比接种链格孢的甜瓜GLU基因相对表达量变化显著,从贮藏第6 d开始接种组显著高于对照组。贮藏过程中伽师瓜GLU相对表达量从第9 d开始始终高于86-1甜瓜;贮藏第6 d时86-1甜瓜GLU基因相对表达量增加显著，是同时期伽师瓜的1.44倍(p<0.01),第9 d伽师瓜GLU基因相对表达量显著升高,到贮藏第15 d达到最大值，是86-1甜瓜2.74倍(p<0.01)。

图8 接种链格孢后伽师瓜和86-1甜瓜GLU基因相对表达量的变化Fig.8 Changes of GLU gene relative expression after inoculation of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon Alternaria alternata

2.7 甜瓜病斑直径与病程相关蛋白活力及其基因相对表达量的相关性分析

采用SPSS 对伽师瓜病斑直径与病程相关蛋白及其基因相对表达量的相关性分析(表2)。

由表2可知,伽师瓜果实在接种贮藏0～21 d几丁质酶活力与病斑直径呈显著正相关,与β-1,3-葡聚糖酶、CHT1、CHT2、GLU基因相对表达量呈正相关,在贮藏24～30 d,几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶,CHT1、CHT2基因相对表达量与伽师瓜病斑直径呈负相关。86-1甜瓜贮藏0～21 d几丁质酶活力、β-1,3-葡聚糖酶活性与病斑直径呈显著正相关,CHT1、CHT2、GLU基因相对表达量呈正相关,贮藏24～30 d几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶,CHT1、CHT2、GLU基因相对表达量病斑呈负相关。说明在链格孢侵染甜瓜果实与果实互作过程中病程相关蛋白在早期及中期发挥了积极的作用,一旦病斑开始扩展,病程相关蛋白抗病作用将显著降低,贮藏后期,酶活性及基因相对表达量下降,原因可能是受甜瓜果实作为病原微生物的营养物质及宿主,无法抵抗病原菌的侵染,抗病能力下降,果实腐烂严重。

3 讨论

植物受到病原微生物侵染时体内乙烯大量合成,被内质网上His激酶类受体家族I型和II型识别,激活植物防御基因和病程相关蛋白基因的表达,使植物建立抗病性反应[13]。有报道显示β-1,3-葡聚糖酶抗病作用不仅表现在破坏病原微生物的细胞壁阻止其生长,同时其水解产物还可以激发植物产生系统获得性抗性,使植物有效低于外界侵染[14]。几丁质酶作为植物抗病研究最广泛的酶之一,在正常环境中几丁质酶活性及其表达量较低,当外界环境胁迫作用,几丁质酶含量迅速升高,来诱导植物启动防御体系[15]。如香蕉受尖孢镰刀菌侵染,几丁质酶活性和几丁质酶基因表达水平显著提高[16]。SA、BTH、UV等诱导也可诱导植物几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性增强[17-19]。

本实验研究发现,链格孢侵染胁迫使甜瓜果实几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性迅速升高,且维持在较高水平来抵御微生物侵染同时利用克隆得到的CHT1、CHT2、GLU基因研究甜瓜受链格孢侵染后病程相关蛋白表达量变化发现,链格孢能够显著诱导伽师瓜和86-1甜瓜的几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶基因相对表达量升高,在链格孢侵染初期,基因表达显著上调,抗病能力增强,贮藏后期,甜瓜果实病程相关蛋白基因相对表达量下降,原因可能受甜瓜果实作为病原微生物的营养物质及宿主,无法抵抗病原菌的侵染,抗病能力下降,果实腐烂严重。在整个贮藏过程中伽师瓜始终保持较高表达量水平,且增幅显著高于86-1甜瓜,这可能是伽师瓜比86-1甜瓜抗链格孢病害的原因之一。

相关性分析表明伽师瓜和86-1甜瓜病斑直径与酶活性及相基因表达量在贮藏初期(0～21 d)呈正相关性,在贮藏末期(24～30 d)伽师瓜果实几丁质酶活力、β-1,3-葡聚糖酶活性,CHT1、CHT2基因相对表达量与病斑直径呈负相关;86-1甜瓜几丁质酶活力、β-1,3-葡聚糖酶活性,CHT1、CHT2、GLU基因相对表达量与病斑直径呈负相关。贮藏0～21 d 86-1甜瓜病斑直径与几丁质酶活性呈显著正相关。且伽师瓜接菌后几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性和其基因相对表达量显著高于86-1甜瓜,导致伽师瓜的病斑直径低于86-1甜瓜。推测几丁质酶,β-1,3-葡聚糖酶可能在伽师瓜抗链格孢过程中起关键作用。

4 结论

接种链格孢后,伽师瓜的病斑直径显著低于86-1甜瓜。伽师瓜通过增强病程相关蛋白酶活性并维持酶活性在较高水平来抵御链格孢的侵染,几丁质酶及β-1,3-葡聚糖酶活力在接种后升高,伽师瓜酶活力高于86-1甜瓜,且伽师瓜CHT1基因表达量从贮藏第12 d起显著高于86-1甜瓜,CHT2基因表达量在贮藏9～27 d显著高于86-1甜瓜,GLU基因表达量从第6 d开始迅速升高,并到贮藏结束时始终高于86-1甜瓜,且在贮藏前期(0～21 d)与病斑直径呈正相关,说明病程相关蛋白在植物抵御病原微生物侵染的过程中起到了关键作用,并且在侵染中期作用显著。

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Effectsofactivitiesandgeneexpressionofpathogenesis-relatedproteinsinmuskmelonfruitinoculatedwithAlternariaalternata

ZHANGPei-ling,HUANGWei,MALing,FENGZuo-shan,BAIYu-jia*

(College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

TS255.1

1002-0306(2017)18-0290-06