上饶市乙型流感病毒耐药基因分析

张艳燕， 赖 宇， 朱 琳， 熊 英， 李健雄， 程畅河

上饶市乙型流感病毒耐药基因分析

张艳燕1， 赖 宇2， 朱 琳1， 熊 英3， 李健雄3， 程畅河2

目的分析上饶市乙型流感病毒耐药基因，为临床用药和疾病控制提供依据。方法从哨点医院采集疑似流感患者咽拭子样本，接种犬肾传代细胞（Madin-Darby Canine Kidney，MDCK）及进行分离培养。选择分离到的乙型（即B型）流感病毒株进行核酸提取后进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR），扩增神经氨酸酶（neuraminidase，NA）基因并进行核苷酸测序，采用DNA Star6.0、Mage5.0生物软件对测序结果进行分析处理，推导出氨基酸序列，进行基因特性分析。结果7 株乙型流感病毒NA基因同源性高达99.5%以上，NA蛋白催化活性位点和辅助位点均无氨基酸替换。结论7株毒株均对流感病毒NA抑制剂药物敏感，但仍应加强对流感病毒的耐药性监测。

乙型流感病毒； 耐药； 神经氨酸酶基因

Abstract: ObjectiveTo characterize the neuraminidase (NA) genes of in fluenza B virus in Shangrao.MethodsThe specimens of nasopharyngeal swabs were collected from patients with in fluenza-like symptoms in in fluenza sentinel hospital. Seven strains of in fluenza B virus were randomly selected for culture and isolation in Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells (MDCK Line).Viral RNA was extracted. Fragments of NA genes were ampli fied by one-step RT-PCR and then were sequenced. The data obtained were analyzed with software DNAStar 6.0 and Mage 5.0. The deduced amino acid sequences were examined to explore the features of NA gene.ResultsThe NA gene showed high homology of nucleotides between the 7 strains of in fluenza B virus. No amino acid substitution was found in catalytic or framework residues of the deduced amino acid sequences of NA gene.ConclusionsAll the 7 strains of in fluenza B virus were sensitive to neuraminidase inhibitors. However, ongoing resistance surveillance is necessary for control and prevention of in fluenza.

Key words:in fluenza B virus; resistance; neuraminidase gene

流感病毒分为甲型、乙型和丙型3类，以甲型和乙型流感病毒最为常见。其中乙型即B型流感病毒是感染人类的主要病原体之一，虽然对人类致病性较低，呈暴发和小流行，不引起世界性流感大流行，但在某些特定情况下造成危害不应忽视[1]。其临床主要治疗药物为神经氨酸酶抑制剂（NAI），随着长时间的使用该类药物，耐药毒株也随之出现并引起重视。本研究分析江西省上饶市乙型流感病毒神经氨酸酶（NA）基因特征，从而分析了我市乙型流感病毒的耐药性，为临床用药和疾病控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本选择

从上饶市人民医院采集的疑似流感患者咽拭子样本接种于犬肾传代细胞（Madin-Darby Canine Kedney，MDCK），细胞进行病毒分离，采用血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）鉴定出阳性毒株，按照样本采集的时间分层抽样随机选取7株乙型流感病毒毒株（所有毒株均经国家流感中心复核鉴定）。

1.2 方法

1.2.1病毒核酸提取和扩增 用德国Qiagen 公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂提取以上选取的7株乙型流感病毒毒株的RNA；采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit 试剂盒并加入引物（NA-5’[2]上引物 GCAGAAGCAGAGCATATTCTTAG，下引物 ATGGACAAATCCTCCCTTGATGC ；NA-3’[3]上引物 GCACTCCTAATTAGCCCTCATAGA，下引物 AGGACAATTGTTCAAAC）进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）（基因扩增反应条件[4]：60 ℃，1 min ；42 ℃，10 min ；50 ℃，30 mim ；95 ℃，15 min。PCR 循 环 如 下 ：94 ℃，40 s；50 ℃，40 s； 72 ℃，1 min，30 s；35次 循 环，72 ℃，10 min.）。

1.2.2核苷酸序列测定 PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测定。

1.2.3序列分析 采用DNAStar6.0、Mage5.0序列分析软件[5]对测序后核苷酸进行分析，以B/Beijing/1/1987（国家流感中心指定）的NA基因序列作为参比分析，序列收录号为M54967[4]。

2 结果

2.1 基因遗传进化分析

选取的7株上饶市乙型流感病毒均为Yamagata系，其编号分别为：B/j i a n g x i x i n z h o u/1 1 9/2 0 1 4、B/j i a n g x i x i n z h o u/1 1 4 1/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 1 6 6/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 1 7/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 3 9/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 5 2/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 3 3 2/2 0 1 4。

在NA基因氨基酸序列的种系进化树（图1）上可见7株毒株与B/beijing/1/1987比较均在同一个分支上，其中B/jiangxixinzhou/1166/2014与其他6株有略微差异，因此存在一个小的分支。

2.2 基因核苷酸和氨基酸同源性

经生物软件分析，与B/Beijing/1/1987的序列进行比较，核苷酸同源在93.4%～93.7%，氨基酸同源性均为92.5%，而这7株病毒之间NA基因核苷酸序列的同源性为99.5%～100%；氨基酸序列的同源性达到99.4%～100%（表1和表2）。

图1 上饶市乙型流感病毒NA基因进化树Figure 1 Phylogenetic tree for 7 strains of in fl uenza B virus detected in Shangrao in terms of neuraminidase gene

表1 7株乙型流感病毒NA基因核苷酸的同源性分析Table 1 Nucleotide homology of NA gene between 7 strains of in fl uenzaBvirus（%）

2.3 NA基因耐药性位点分析

根据核苷酸序列推导出NA基因氨基酸序列前500位，其中对NA基因酶催化活性位点（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、 R374和406）氨基酸和辅助位点（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294，E428位）氨基酸7株毒株均未发生替换，说明当前情况下NA基因耐药性未发生变化。

3 讨论

乙型流感病毒变异进化的主要机制是基因片段重配和碱基的插入或缺失，这既可以发生在Victoria系和Yamagata系之间，也可发生在同一系别不同分支的病毒之间[6]。虽然乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系进化特点不尽相同，但它们具有在人群中共存、共同进化的特征[7]。流感病毒NA是流感病毒重要的表面糖蛋白，具有抗原性，可以催化唾液酸水解，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞[8]。NA通过抗原性转变可以改变病毒的毒力和耐药性，当病毒发生变异从而使它们更有利于生存或更有利于逃避宿主免疫应答时，新毒株会代替老毒株，导致病毒进化[6]。本实验通过对7株乙型流感病毒NA基因的测序分析，从进化树、核苷酸和氨基酸的同源性等3方面比较，均表明7株毒株与标准株B/beijing/1/1987之间的差距很小，在进化树上处于同一分支上；核苷酸和氨基酸的同源性均在90%以上；从氨基酸序列上看，影响耐药的基因位点均未发生改变；说明当前乙型流感病毒NA基因仍未发生变异。

表2 7株乙型流感病毒NA基因氨基酸序列的同源性分析Table 2 Homology of the deduced amino acid sequence of NA gene between 7 strains of in fl uenza B virus（%）

临床上治疗乙型流感的药物仅有依赖NAI，流感病毒NA被作为药物靶点[9]。全基因组分析证明影响病毒耐药性的主要是NA基因酶催化活性 位 点（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、 R374和 406）氨基酸和辅助 位 点（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294，E428位）氨基酸[7，10]。本实验结果发现这些影响耐药性的位点均未发生改变，表明流感病毒对NAI药物敏感。这也和熊英等[4]报道的江西省内2009－2012年乙型流感病毒耐药基因分析相一致，说明在本地区范围内迄今为止尚未出现乙型流感病毒耐药现象。另外，有报道NA基因在198、222、250、402等位点基因突变可以降低NAI的灵敏度[11]。本次实验亦发现除B/jiangxixinzhou/1166/2014外其他6株毒株基因在氨基酸402位都发生了A402T的替换，这些替换点位说明乙型流感病毒的变异可能已经影响了NAI的灵敏度，但具体对临床使用药物的影响，尤其耐药性的影响，仍有待进一步的研究。

[1] HAI R，MARTINEZ-SOBRIDO L，FRASER KA，et al.Influenza B virus NS1-truncated mutants ：live-attenuated vaccine approach[J]．J Virol，2008， 82 （21） ：10580-10590.

[2] WHO. WHO information for laboratory diagnosis of pandemic（H1N1） 2009 virus in humans -revised[R]. Geneva： WHO.2009：15.

[3] WHO. WHO information for molecular diagnosis of influenza virus in humans-update[R]. Geneva：WHO，2011：16.

[4] 熊英，龚甜，李健雄，等. 江西省2009年－2012年B型流感病毒耐药基因分析[ J] .中国卫生检验杂志， 2014， 18 （15）：158-160.

[5] TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance， and maximum parsimony methods [J]. Mol Biol Evol， 2011，28（10）：2731-2739.

[6] 成艳辉，王钊，肖宁，等. 2013－2014年中国B型流感病毒抗原性及基因特性分析[ J] .中华实验和临床病毒学杂志，2015，29（5）.385-390.

[7] LIN YP，GREGORY V，BENNETT M，et a1．Recent changes among human in fl uenza viruses[J]．Virus Res，2004，103（1-2）：47-52．

[8] 黄维娟，李希妍，谭敏菊，等. 2013-2014年流感流行季节中国大陆B型流感病毒对NA的敏感性[ J].病毒学报，2015，6（2）：152-156.

[9] BURNHAM AJ， BARANOVICH T，Goverkoca EA.Neuraminidase inhibitors for influenza B virus infection[J].Antiviral Research，2013，100（2）：520-534.

[10] 郭元吉，程小雯.流行性感冒及其实验技术[M] .北京：中国三峡出版社，1997：1-43.

[11] 岳秀芳，夏咸柱，于志君，等.两株B型流感病毒的基因组序列分析[J]. 中国人兽共患学报，2013，29（3）：267-273.

Neuraminidase gene pro filing of in fluenza Bvirus in Shangrao

ZHANG Yanyan, LAI Yu, ZHU Lin, XIONG Ying, LI Jianxiong, CHENG Changhe. （Department of Laboratory Medicine, Shangrao Center for Disease Control and Prevention, Shangrao Jiangxi 334000, China）

R373.13

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0538-03

10.16718/j.1009-7708.2017.05.010

2017-01-03

2017-02-27

2014年江西省医学学科省市共建计划项目（201412）。

1. 上饶市疾病预防控制中心检验科，江西上饶 334000；

2. 江西医学高等专科学校药学系；

3. 江西省疾病预防控制中心检验科。

张艳燕（1984—），女，本科，主管技师，主要从事病毒的检测工作。

程畅河，E-mail：chengchanghe@hotmail.com。