酶催化降解四溴双酚A反应引起的碳纳米管急性毒性变化

卢坤，董仕鹏，高士祥，毛亮

南京大学环境学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京210046

酶催化降解四溴双酚A反应引起的碳纳米管急性毒性变化

卢坤，董仕鹏，高士祥，毛亮*

南京大学环境学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京210046

辣根过氧化物酶催化去除四溴双酚A的反应能够改变多壁碳纳米管(multiwall carbon nanotubes, MWCNTs)在水环境中的稳定性。为探究该反应对碳纳米管生态毒性效应的影响，选择大型蚤(Daphnia magna)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)作为受试生物，分别考察了反应前后MWCNTs对大型蚤的急性毒性以及对斜生栅藻的生长抑制和藻细胞色素的影响。结果表明，在1～10 mg·L-1的暴露浓度下，与原始的MWCNTs相比，反应后的MWCNTs对大型蚤的急性毒性明显减弱。在10 mg·L-1的暴露剂量下，原始的MWCNTs造成大型蚤的死亡率高达65%，而反应后的MWCNTs引起大型蚤的死亡率仅为23%。此外，反应前后的MWCNTs对斜生栅藻的生长均有抑制作用。随着暴露浓度的增大，藻细胞密度、叶绿素a和b的含量逐渐降低。与原始MWCNTs相比，反应后的MWCNTs对斜生栅藻的毒性明显减弱。上述研究结果为评价MWCNTs的环境风险提供了基础数据。

碳纳米管；四溴双酚A；大型蚤；斜生栅藻；毒性；环境风险

Received10 January 2017accepted10 March 2017

Abstract: The physicochemical properties of multiwall carbon nanotubes (MWCNTs) were modified by the tetrabromobisphenol A (TBBPA) radicals resulting from the reaction mediated by horseradish peroxidase. The Daphnia magna and Scenedesmus obliquus were selected in this study as the testing organisms to reveal the toxic response of the MWCNTs and the modified MWCNTs resulted from the enzymatic reaction. Our experimental results indicated that the mortality of Daphnia magna caused by the modified MWCNTs was much lower than that of the pristine MWCNTs did. Both the cell density and the pigment (chlorophyll a and b) content of Scenedesmus obliquus were decreased after the exposure of MWCNTs and modified MWCNTs. However, the above effects induced by the pristine MWCNTs were stronger than that the modified MWCNTs did. The above results suggest that the toxicity of MWCNTs was changed by the enzymatic reaction, providing a preliminary data for evaluating the risks of MWCNTs in the natural environment.

Keywords: MWCNTs; TBBPA; Daphnia magna; Scenedesmus obliquus; toxicity; environmental risks

碳纳米管作为一种新兴的功能纳米材料，由于其优良的物理化学性质，目前已经被广泛应用在电子、光学、生物医学、药学、能源、催化和水处理等领域[1-3]。然而随着其大量的生产和广泛的应用，碳纳米管会不可避免地释放到环境中并且能够影响环境中污染物的迁移、转化行为以及生物可利用性[4-9]。目前大多数的研究侧重于碳纳米材料对污染物环境行为的影响，鲜有文献报道污染物在环境中的迁移转化行为对碳纳米材料本身物理化学性质的改变以及其环境行为的影响。碳纳米材料物理化学性质的微小变化都可能改变其环境行为以及毒性[10-12]。例如Hu等[11]研究发现在光照和水合作用下，石墨烯能够被氧化且片层厚度减小，使得被氧化后的石墨烯更容易团聚，降低了石墨烯对藻细胞的毒性。此外，包裹了斑马鱼代谢物的石墨烯尺寸变小，能够延迟斑马鱼胚胎的孵化，甚至造成畸形和死亡现象[12]。

在自然环境中，植物、动物和微生物能够分泌多种多样的酶[13-14]；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)是一种植物分泌出来的过氧化物酶、并广泛存在于环境中，在过氧化氢或者其他有机过氧化物存在的条件下，可以催化去除含酚环的芳香族化合物，并产生自由基[15-17]。如Colosi等[18]报道，4-甲氧基苯酚在HRP催化作用下产生自由基，该类自由基能够攻击全氟化合物的碳-氟键，进而使其降解。四溴双酚A (TBBPA)的全球使用量约为120 000至150 000吨每年，这使得其成为环境中最常被检测到的溴代阻燃剂[19-20]。

本文在发现辣根过氧化物酶(HRP)催化去除四溴双酚A(TBBPA)反应能够改变多壁碳纳米管物理化学性质的基础上，进一步利用实验室培养的大型蚤和斜生栅藻为受试生物来评价该反应对碳纳米管本身所造成的毒性变化，为进一步评价碳纳米管对水生生物的毒性效应和环境风险提供了科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与材料

仪器：紫外可见分光光度计(Cary 50，美国)，细胞超声破碎机(JY88-II，南京以马内利仪器有限公司)，恒温培养箱(HZQ-F160，成都一科仪器设备有限公司)，离心机(Bisfuge Stratos，美国)，环境扫描电镜(FEI Quanta x50，美国)，光照培养箱(PGX-35013，宁波海曙赛福实验仪器厂)，LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，真空抽滤机(SHZIII，南京科尔仪器有限公司)，动态激光散射仪(Nano ZS, Malvern)。

试剂：辣根过氧化物酶(HRP)和四溴双酚A(TBBPA，> 97%)购自Sigma公司，多壁碳纳米管购自深圳纳米港。根据厂家提供的信息，原始的MWCNTs管径为20～40 nm，长度< 5 μm，纯度> 97%，比表面积为30～50 m2·g-1。丙酮、甲醇、过氧化氢等均为分析纯。

1.2 试验生物

大型蚤(Daphnia magna)由中国科学院生态环境研究中心提供，为实验室条件下培养3代以上的单克隆品系。参照《水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法》(GB/T 132662—91)(国家环境保护局，1991)将大型蚤培养在曝气72 h以上的稀释水中，温度控制在(23±1) °C，光暗比为12 h:12 h。每24 h给大型蚤喂食一定量浓缩的斜生栅藻。实验前一天挑选怀卵的大型蚤放入已配好的稀释水中，待母蚤产出足够幼蚤后，取24 h内游动活泼的幼蚤进行暴露实验。

实验用斜生栅藻(Scenedesmus obliquus, S. obliquus)购买于中国科学院水生生物研究所，并参照OECD 201标准方法进行培养。斜生栅藻培养在SE培养基中，培养温度为26 °C，光暗比为12 h:12 h。

1.3 材料制备及表征

反应后的多壁碳纳米管(modified MWCNTs)的制备参考笔者之前的文献[21]。将10 μmol·L-1TBBPA、10 μmol·L-1H2O2、0.02 U·mL-1HRP和5 mg·L-1的MWCNTs置于250 mL锥形瓶中，反应60 min后，通过抽滤装置将MWCNTs用0.22 μm的水相滤膜过滤出来，并依次用甲醇和超纯水清洗3次以去除碳纳米管表面吸附的有机物，最后将MWCNTs冷冻干燥处理以得到modified MWCNTs。分别对原始MWCNTs和modified MWCNTs进行扫描电镜表征(图2)。

分别称取1 mg的MWCNTs和modified MWCNTs置于40 mL顶空瓶中，然后加入20 mL超纯水配制成50 mg·L-1的溶液。将溶液进行超声分散，然后分别取1 mL进行动态光散射测定[22]，剩下的19 mL溶液静置在水平桌面上并进行遮光处理，在0、2、8、24、48、72、120和360 h进行拍照记录其聚集状态。

1.4 实验方法

1.4.1 大型蚤急性毒性实验

实验设定MWCNTs和modified MWCNTs的暴露浓度为1、2.5、5、7.5、10 mg·L-1，同时设定空白组。每个处理设置4个平行，暴露试验在100 mL烧杯中进行。每个烧杯中盛有30 mL暴露液，随机投放入10只新生的大型蚤(< 24 h)。观察并记录48 h后大型蚤的受抑制个数。以玻璃棒轻触烧杯壁，大型蚤不运动为实验终点，仅触角运动也视为受抑制。

1.4.2 斜生栅藻

实验方法参考Li等[17]的研究。首先准备若干经过高温灭菌处理过的150 mL锥形瓶，每个锥形瓶中含有40 mL MWCNTs/modified MWCNTs溶液和10 mL对数期的斜生栅藻母液，最终使得S. obliquus的初始浓度为7.5×105cell·mL-1。设置的MWCNTs和modified MWCNTs溶液的暴露浓度设置为0.1、 1、5、10、20、25 mg·L-1。同时设置空白对照组，每组设置3个平行。将锥形瓶置于光照培养箱中进行培养，分别在0、12、24、48、72、96 h测定藻液的细胞密度。藻液的细胞密度测量采用镜检法结合分光光度法，通过紫外可见分光光度计测定685 nm处的藻液的吸光度，用血球计数板镜检藻细胞密度，并绘制藻的细胞密度-吸光值标准曲线(见图1)。

暴露96 h后，将40 mL斜生栅藻溶液3 600 r·min-1离心10 min，将上清液去除，加入10 mL 90%的丙酮溶液，摇匀，在暗处放置24 h以提取细胞色素，再以3 600 r·min-1离心10 min，取上清液至于比色皿中于664、647 nm处测定溶液的吸光度值。采用如下公式计算叶绿素a、b含量[23]。

图1 斜生栅藻的藻细胞密度-吸光度值标准曲线Fig. 1 The standard curve of cell density of S. obliquus vs. absorption value

图2 MWCNTs与辣根过氧化物酶-四溴双酚 A(HRP-TBBPA)的自由基反应过程示意图Fig. 2 Scheme of reaction between MWCNTs and the radioactive radicals resulting from horseradish peroxidase (HRP)-mediated 14C-labeled tetrabromobisphenol A (TBBPA)

图3 反应前后MWCNTs的扫描电镜(SEM)图Fig. 3 Scan electron microscope (SEM) images of MWCNTs and modified MWCNTs

Chlorophyll a = 11.93 E664- 1.93 E647

Chlorophyll b = 20.36E667- 5.50 E664

其中Chlorophyll a表示叶绿素a的含量；Chlorophyll b 表示叶绿素b的含量。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 反应前后MWCNTs的理化性质改变

在前期的研究工作中，我们已经证明HRP催化TBBPA反应中产生的自由基能够攻击并修饰MWCNTs(称为modified MWCNTs)[21]，如图2所示。修饰后的MWCNs的水和动力学直径在1 h内基本维持在～200 nm，而原始的MWCNTs的水和动力学直径在1 h内从～1 200 nm 急剧增加到3 000 nm。此外，原始的MWCNTs在24 h几乎全部团聚并沉积到容器底部，而modified MWCNTs可以保持长时间的稳定，在360 h内仅沉降～30%[21]。将原始的MWCNTs和modified MWCNTs进行扫描电镜表征，结果如图3所示。从图中可以看出，与原始的MWCNTs相比，modified MWCNTs长度变短。

2.2 MWCNTs/modified MWCNTs对大型蚤的急性毒性

大型蚤暴露于不同浓度的MWCNTs和modified MWCNTs后，活动都明显受到抑制，甚至会出现死亡的情况。MWCNTs和modified MWCNTs对大型蚤的急性毒性效应见图4，实验结果表明：1.0～10 mg·L-1的暴露浓度下，MWCNTs和modified MWCNTs都会对大型蚤的活动造成明显的抑制作用，随着暴露浓度的增加，大型蚤的抑制率升高。从图4中可以看出大型蚤抑制率与暴露浓度存在明显的剂量-效应关系。与原始的MWCNTs相比，modified MWCNTs的毒性明显降低，例如在10 mg·L-1的暴露剂量下，

MWCNTs对大型蚤的抑制率高达65%，而modified MWCNTs引起的抑制率仅为23%。

对暴露48 h后的大型蚤进行光学显微镜观察，结果如图5。从图中可以明显看出，暴露于MWCNTs和modified MWCNTs的大型蚤肠道富集了大量的碳纳米管。但是，与暴露于modified MWCNTs的大型蚤相比，暴露于MWCNTs的大型蚤的外壳、触角以及纲毛等部位有大量团聚的碳纳米管。因此我们推断原始MWCNTs和modified MWCNTs引起的大型蚤急性毒性的差异主要是原始的MWCNTs在水体中不稳定，容易发生团聚现象，当与大型蚤同时存在时，能够大量聚集在大型蚤的外壳、触角以及纲毛等部位，严重阻碍了大型蚤的活动，甚至引起死亡现象。Zhu等[24]也得到了类似的结论：碳纳米材料在较高浓度下会团聚在大型蚤体表周围，抑制其活动。而modified MWCNTs在可以较长时间的均匀的分散在水体中，虽然大型蚤体表可以吸附少量的modified MWCNTs，但是仍然没有形成较为明显的团聚现象(图4)，因此对大型蚤的活动几乎不会产生影响。但是从抑制率上来看，却有7.5%～15%的大型蚤受到抑制，说明该毒性效应主要是由大型蚤体内聚集的modified MWCNTs所引起的。其原因可能是大量的碳纳米管存在与大型蚤的肠道内能够导致其肠道细胞的损伤，从而引起大型蚤的死亡[25]。当modified MWCNTs的暴露浓度增加到10 mg·L-1后，就能够在大型蚤体表看到少量吸附的modified MWCNTs，并且大型蚤的抑制率从15%增加到23%，说明当暴露浓度增大时，体表吸附逐渐成为抑制大型蚤活动的主要因素。

图4 不同MWCNTs和modified MWCNTs浓度下 大型蚤的抑制率(对照组抑制率为0)Fig. 4 Inhibition rate of Daphnia magna at different exposure concentration of MWCNTs and modified MWCNTs (The inhibition rate in control is 0)

图5 暴露于不同处理组(对照、10 mg·L-1MWCNTs和10 mg·L-1modified MWCNTs)下大型蚤的光学显微镜观察结果Fig. 5 Light microscope pictures of Daphnia magna exposed to artificial freshwater (control), MWCNTs and modified MWCNTs (The concentrations of MWCNTs and modified MWCNTs were 10 mg·L-1)

2.3 MWCNTs/modified MWCNTs对斜生栅藻生物量的影响

暴露96 h后，不同浓度的MWCNTs和modified MWCNTs对斜生栅藻细胞密度的影响见图6。实验结果表明，在1.0～25.0 mg·L-1的暴露浓度下，两者都会对斜生栅藻的生长产生明显的抑制作用。低浓度暴露下(0.1 mg·L-1)，处理组中S. obliquus的生长与对照组相比，没有显著差异(P>0.05)。随着暴露浓度的增加，抑制作用会越来越明显，存在显著的剂量-效应关系。对比反应前后碳纳米管对斜生栅藻生长的影响，可以发现相比于MWCNTs暴露组，modified MWCNTs对斜生栅藻生长的抑制作用明显减弱。例如在20 mg·L-1的暴露剂量下，暴露于MWCNTs和modified MWCNTs的斜生栅藻细胞的密度分别为16×105个·mL-1和20×105个·mL-1。这

主要是由于斜生栅藻细胞的生长和繁殖需要光照，而由于MWCNTs在水体中不稳定，容易发生团聚，因此形成的团聚体很容易将藻体包裹住，从而使藻细胞无法接触到光照，从而抑制其生长和繁殖。杨晓静等[26]报道了纳米二氧化钛和单壁碳纳米管对普通小球藻生长抑制的影响，结果发现与纳米二氧化钛相比，单壁碳纳米管能够发生凝聚并吸附大量的小球藻细胞，因此严重抑制了小球藻的正常生长。modified MWCNTs能够均匀的分散在水中，不会形成团聚体，因而对斜生栅藻细胞的生长和繁殖的影响明显弱于原始的MWCNTs。

2.4 培养96 h后MWCNTs/modified MWCNTs对斜生栅藻细胞色素含量的影响

暴露96 h后，不同浓度MWCNTs和modified MWCNTs对斜生栅藻的叶绿素a和b的影响如图7所示。从图中可以看出，各暴露组叶绿素a和b均低于对照组(P<0.05)，随着暴露浓度的增加叶绿素a和b的含量呈下降趋势。但是无论对叶绿素a还是叶绿素b而言，modified MWCNTs的影响都要弱于MWCNTs的影响。

图6 不同MWCNTs和modified MWCNTs浓度 下斜生栅藻细胞密度Fig. 6 The cell density of S. obliquus exposed to different concentrations of MWCNTs and modified MWCNTs

图7 培养96 h后不同MWCNTs和modified MWCNTs浓度对斜生栅藻光和色素含量的影响Fig. 7 Effect of different concentrations of MWCNTs and modified MWCNTs on the photosynthetic pigment content of Scenedesmus obliquus after 96 h exposure

光合色素是客观反映植物利用光照能力的一类重要指标，能够作为判断植物光合生理能力、反映环境胁迫状况的依据，其含量的变化能够较好地反映生物各阶段生长发育正常与否[27]。根据以上结果可以看出，无论是原始的MWCNTs还是modified MWCNTs，都能够影响到斜生栅藻细胞的正常生长，从而使得叶绿素a和叶绿素b的含量下降。但是与modified MWCNTs相比，原始的MWCNTs容易包裹住斜生栅藻细胞，对其摄取光照能力的影响较大，所以对其光合生理能力较大，从而叶绿素a和b的含量较低。此外，由于光合器官是植物细胞内活性氧的主要来源之一，而光合色素极易受到活性氧的攻击[28]，因此仍需进一步探索MWCNTs的暴露引起细胞内活性氧含量的变化。

目前关于碳纳米管对水生生物毒性的研究较多，但可能并未考虑到自然过程所引起的碳纳米管自身物理化学性质的变化以及对生物毒性的变化。我们的实验结果表明辣根过氧化物酶催化去除四溴双酚A的反应能够改变多壁碳纳米管(MWCNTs)在水环境中的稳定性。并且以大型蚤和斜生栅藻作为水环境中的两种典型生物来来进行毒性研究，可以发现相比于原始的MWCNTs，反应后的MWCNTs的毒性明显减弱。因此，有必要加强研究碳纳米管在自然环境中物理化学性质的改变以正确评价其潜在的环境风险。

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◆

TheToxicEffectofMultiwallCarbonNanotubesModifiedbythePeroxidase-MediatedTetrabromobisphenolAReactiononDaphniamagnaandScenedesmusobliquus

Lu Kun, Dong Shipeng, Gao Shixiang, Mao Liang*

State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210046, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170110001

2017-01-10录用日期2017-03-10

1673-5897(2017)3-597-07

X171.5

A

毛亮 (1984—)，男，环境科学与工程专业博士，副教授，主要研究方向为酶催化去除水中新兴污染物的行为与机制。

江苏省自然科学基金(BK2011576)

卢坤(1989-)，男，博士研究生，研究方向为碳纳米材料的环境风险，E-mail: kunluay@163.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: lmao@nju.edu.cn

卢坤, 董仕鹏, 高士祥, 等. 酶催化降解四溴双酚A反应引起的碳纳米管急性毒性变化[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 597-603

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