城市污水厂污泥倾倒对海洋生物的毒性研究

吕向立，吴鹏，朱艾嘉，倪志鑫，张敬怀，陈斌

国家海洋局南海环境监测中心，广州 510300

城市污水厂污泥倾倒对海洋生物的毒性研究

吕向立，吴鹏，朱艾嘉，倪志鑫，张敬怀，陈斌*

国家海洋局南海环境监测中心，广州 510300

以广州市和佛山市的5个城市污水处理厂的污泥为实验对象，选取费氏弧菌、蒙古裸腹溞、卤虫、裸项栉鰕虎鱼仔鱼4种不同营养级的海洋生物为受试对象，结合化学分析方法，研究广州区域周边污水污泥浸出液的生物毒性效应。结果显示各污水污泥浸出液的毒性均较大，且浸出液的Cu污染浓度较高；广州市污水污泥对4种受试生物的毒性效应要高于佛山市。从污泥毒性对受试生物的选择性方面分析，发现卤虫筛分能力强且灵敏度高，而费氏弧菌则相关性好且方法简捷。研究结果为反映城市污泥的生物毒性强度和选择合适毒性评价受试生物提供基础数据。

污泥浸出液；重金属；费氏弧菌；蒙古裸腹溞；卤虫；裸项栉鰕虎鱼；生物毒性

Received16 February 2017accepted5 May 2017

Abstract: Five municipal sewage sludge leachate from Guangzhou and Foshan was selected for exploring the biological toxicity effect on four marine organisms at different trophic levels, including Vibrio fischeri, Moina mongolica, Artemia franciscana, larval Ctenogobius gymnauchen. Results showed that the biological toxicity of the leachate was significant, in which higher Cu concentration was found. Furthermore, the toxicity effect on four marine organisms was higher in Guangzhou than Foshan. Artemia franciscana was sensitive to all the samples, and exhibited different LC50to different sludge leachate. EC50for Vibrio fischeri was highly correlated with LC50for Artemia franciscana and Moina mongolica, while its toxicity test approach was much simpler. The study can provide data sources for the biological toxicity evaluation of municipal sewage sludge and for selecting suitable marine organisms for this toxicity evaluation.

Keywords: sewage sludge leachate; heavy metal; Vibrio fischeri; Moina mongolica; Artemia franciscana; larval Ctenogobius gymnauchen; biological toxicity

污水污泥是指污水厂处理城市废水后产生的固态废弃物，据不完全统计，全国每年污泥产量达到2 200万吨，其中有80%没有得到妥善处理[1]。污水污泥中含有的大量重金属、病毒和有机物污染物等，一旦进入环境后会对生态系统造成危害，并通过食物链影响人类健康[2-3]。污水污泥中的污染物质组成复杂，存在复合污染效应，对污泥浸出液的化学分析仅能检测到特定种类的污染物浓度，而以受试生物为基础的生物毒性效应分析能较直观全面反映出污泥浸出液的毒性。

国内外许多学者对污水污泥的生物毒性做过研究，Gyung等[4]使用费氏弧菌和卤虫分别分析了不同来源的污水污泥的急性生物毒性和累积生物毒性，李娟英等[5]使用黑鲷和海洋藻类研究污水污泥浸出液对海洋生物的急性毒性作用和生长抑制作用，尹杰等[6]使用体外生物测试工具检测了污水污泥的基线毒性和遗传毒性水平，上述研究均表明污水污泥具有较强的生物毒性。同时有研究发现，重金属的化学分析结合多种生物毒性方法可以达到更好的毒性评价效果[7]。

广州和佛山作为珠三角经济圈的2个核心城市，生活污水排放量和污水厂污泥的产量在国内处于前列。城市污水污泥的大量产生，已引起日益严峻的二次污染，成为城市污水处理行业的瓶颈[8]。目前，污水污泥的主要处置方式有填埋、堆肥、焚烧和海洋倾倒等，国内外对于填埋、堆肥和焚烧中有毒污染物的迁移机制和潜在环境危害有较多研究[9-12]，而与海洋倾倒相关甚少。某些处置方法在实施过程中释放的有毒物质存在扩散到周围的水环境和大气环境的隐患，有毒物质随地表径流进入水环境后，可对生态系统和食物链造成较大范围的危害[13]。当前，国内外关于采用多种海洋生物综合评价污水污泥生物毒性的报导较少。本研究通过化学方法测定了污泥重金属污染物含量，并以多种海洋生物为受试生物评价了广州周边污水污泥的毒性效应强度，对比分析4种海洋受试生物用于评价污水污泥的优缺点，为污水污泥的海洋倾倒处置研究提供参考数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 污水污泥样品

选取了广州和佛山共5个污水处理厂出厂终端污泥作为测试样品，不同污水处理厂的运行参数如表1所示。样品采集后装入聚乙烯袋避光密封保存，当天运回实验室，置于-18 ℃保存并在2个月内进行毒性测试。

1.1.2 海洋受试生物

发光细菌实验使用费氏弧菌(NRRL-B-11177)冻干菌粉，购于美国哈希公司。

蒙古裸腹溞为实验室自培养，培养条件为：水温22 ℃～27 ℃、盐度26～30、自然光照，并每日投喂一定数量的微藻。

表1 污水处理厂参数Table 1 Parameters of sewage treatment plants

注：A2/O为厌氧缺氧好氧法；UNITANK为一体化活性污泥法。

Note: A2/O stand for Anaerobic-anoxic-oxic process; UNITANK stand for united activated sludge process.

卤虫采用美国Advanced Hatchery Technology INC.公司的卤虫卵进行孵化后使用，培养条件为：水温25 ℃，盐度32～34，光强2 000 lux。

裸项栉鰕虎鱼仔鱼为10日龄，购自广东省实验动物监测所，培养条件为：水温35 ℃～30 ℃、盐度20～30、自然光照，并每日投喂卤虫无节幼体或轮虫。

1.2 实验方法

1.2.1 浸出液的制备

实验前将污泥样品解冻后烘干，将一定质量的污泥(g)与人工海水(mL)(盐度为30，pH为8.0)按1∶4质量体积比进行混匀，然后以3 000 r·min-1搅拌30 min，静置1 h，采用虹吸法取出上层液体，经0.45 μm的滤膜过滤处理后即为储备污泥浸出液[14]。

在每种受试生物实验组中取储备污泥浸出液经2 mg·L-1的NaCl溶液稀释得到5个等比浓度组(原液浓度的100%、50%、25%、12.5%、6.25%)并设置一个空白对照组(0%)，每个浓度组设置3个平行。

1.2.2 浸出液重金属分析

浸出液中重金属含量分析按照GB17378.4—2007 海洋监测规范使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行测定[15]。

1.2.3 受试生物的毒性测试

费氏弧菌在15 ℃恒温条件下加入活化菌液并在LUMIStox 300发光细菌综合毒性仪上测量反应前和反应30 min后的相对发光强度(RLU)[16]，实验操作和EC50运算按照ISO 11348-3:2009标准进行[17]。

蒙古裸腹溞、卤虫和裸项栉鰕虎鱼仔鱼3个受试生物实验组中每个浓度组每个平行放入10个实验生物个体，30 min内完成分放。蒙古裸腹溞毒性实验持续时间为72 h，卤虫和裸项栉鰕虎鱼仔鱼为96 h，每24 h观察记录受试生物存活情况，并及时移除死亡个体。试验结束时，记录各烧杯中的存活个体数。实验方法和数据处理参照GB/T 18420.2—2009标准[18]。

1.2.4 统计与分析

实验数据相关性分析使用统计学软件SPSS，相关性分析采用基于pearson相关系数的双侧显著性检验。聚类分析选择系统聚类中的组间联结方法，量度标准为平方Euclidean距离。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 浸出液化学分析

通过对广州周边5个污水污泥样品浸出液重金属污染物浓度进行分析，结果显示5个样品的重金属浓度有较大的差异。A1、A4和A5浸出液的重金属浓度明显高于A2和A3；在5个污水处理厂中，A5处理厂中的Cu浓度最高，而A4处理厂中Zn浓度最高，A1处理厂的Cu和Zn浓度都大幅高于A2和A3处理厂。综合分析，5个污水污泥浸出液样品的重金属浓度为A5和A4最高，A1次之，A3和A2最低(表2)。对重金属浓度进行的相关性分析表明，污水污泥中Cu和Cd达到显著相关水平(P<0.01)(表3)，说明2个因子可能存在一定同源性。

有研究显示上海周边污水处理厂污泥浸出液的重金属浓度以Zn最高，Cr和Cu次之[5]，而对广州周边5个污水厂污泥的分析表明浸出液中Cu的浓度最高。郭鹏然等[19]对广州污泥浸出液重金属的研究也显示污泥具有高浓度Cu的特征。

表2 污泥浸出液重金属浓度化学分析Table 2 Concentration of heavy metals in sludge leachates

将重金属化学分析结果与欧盟EN12457.2-2002[20]和国标GB5085.3—2007[21]中有关危险废弃物浸出液的参考限值作对比发现，只有A5处理厂污泥中Cu含量超过欧盟标准，其余重金属含量均远低于欧盟和我国危险废弃物的相关标准，说明污水污泥的毒性尚未达到很严重的环境危害级别。

2.2 污水污泥浸出液生物毒性效应分析

4种不同营养级水平的海洋生物对污水污泥浸出液的毒性效应结果见图1。费氏弧菌的半数效应浓度EC50值反映A5处理厂的污泥毒性最强(9.4%)，其次为A4和A3处理厂的污泥，而A1处理厂污泥毒性(25.7%)和A2处理厂(54.3%)相对较弱；蒙古裸腹溞的半致死浓度LC50值反映出A2处理厂的污泥毒性(55.2%)明显低于A5、A4、A1和A3处理厂的污泥毒性(3.8%～7.7%)；卤虫的LC50值同样反映出A2处理厂污泥毒性(25.6%)最低；5个处理厂污泥对裸项栉鰕虎鱼仔鱼的LC50值都低于5.5%，反映出5个处理厂污泥的毒性都较强(图1)。综合分析4种受试生物的毒性效应发现，A3、A4和A5处理厂污泥浸出液的毒性相对高于A1和A2处理厂污泥，而A2处理厂污泥毒性最低，5个污水处理厂污泥的生物毒性强度基本表现为A5>A4>A3>A1>A2。将污水处理厂参数与综合毒性结果作比对，发现毒性最高的A5污泥和最低的A2污泥分别对应污水处理厂的最高和最低污水日处理量。本研究结果表明生活污水处理厂污泥浸出液具有较强的生物毒性，这与国外一些学者利用发光细菌研究污水污泥毒性获得的结果基本一致[22]。

图1 受试生物LC50(EC50)对比Fig. 1 Comparison of LC50(EC50) values

表3 污泥浸出液重金属浓度相关性系数矩阵(n=5)Table 3 Correlation coefficient matrix of heavy metal concentration in sewage leachates (n=5)

注：**为P<0.01。

Note: ** stands for P<0.01.

根据4种受试生物的LC50或EC50值的毒性效应，通过聚类分析图发现5个污水处理厂的污泥毒性效应聚为明显的3组，其中A3、A4和A5处理厂污泥毒性相近聚为一组，同时A1处理厂污泥毒性聚为单独一组，而A2处理厂污泥毒性经过第三次迭代后形成与前2组有着较大的组间距离的一组(图2)。通过4种生物的毒性试验结合聚类图发现，在输入源同为生活污水情况下，来源于广州的A3、A4和A5污水处理厂在污水日处理量和污泥毒性方面都要很明显高于佛山的A1和A2处理厂污泥。

将5个污水处理厂的污泥生物毒性检测结果与相应污泥浸出液的重金属含量分析结果作比对，发现A5、A4和A1处理厂污泥浸出液的重金属浓度相对较高，与此同时该3个处理厂的污泥生物毒性也较强；而A2处理厂污泥的重金属浓度最低，其污泥表现的生物毒性也最弱；另一方面，A3处理厂污泥浸出液表现的高生物毒性效应与重金属浓度分析结果不一致，这表明该污泥可能受到其他有毒污染物质(如有机污染物等)影响，或者与污染物之间存在协同效应，从而增强了污泥的综合毒性[3]。

图2 污泥浸出液急性毒性聚类分析Fig. 2 Cluster analysis on toxicity of sewage leachates

有研究显示费氏弧菌、蒙古裸腹溞、卤虫和鱼类仔鱼对于Cu、Zn、Cr、Pb和Cd的LC50(EC50)区间分别为0.089～2.19 mg·L-1、0.614～19.1 mg·L-1、4.240～23.0 mg·L-1、0.181～117 mg·L-1和0.117～9.95 mg·L-1[23-30]， Cu、Zn和Cd对于受试生物的毒性更大。本研究中污泥浸出液的Cu和Zn浓度都明显高于上述研究的Cu和Zn的LC50(EC50)区间，因此，推断Cu和Zn可能在综合毒性中的贡献比例较高。有研究显示污水污泥的重金属和其他有机毒性成分比例存在较大地域和处理源的差异性，而Cu和Zn为生活污水主要的重金属污染物[31-33]。

实验结果表明广州周边污水污泥毒性较大，如填埋或大量堆肥可能会存在渗滤液污染环境的问题，如采用海洋倾倒的方式予以处置，可能对海洋环境产生较大的潜在风险，建议不宜采用该方式处置或者经过减毒无害化处理后倾倒。

2.3 4种受试生物毒性方法比较

根据4种海洋受试生物的毒性效应结果进行的pearson相关性分析发现，受试生物费氏弧菌与蒙古裸腹溞和卤虫的毒性效应相关性较高，费氏弧菌与蒙古裸腹溞的毒性结果在P<0.01的水平上显著正相关，费氏弧菌与卤虫在P<0.05的水平上显著正相关(表4)。有研究表明，费氏弧菌的急性毒性方法与许多运用海洋生物作为受试生物的方法都有良好的相关性，这种方法在沉积物毒性评价等生态毒理学领域已经形成一种标准化系统并得到广泛推广[34-36]。

处于较高营养级的裸项栉鰕虎鱼仔鱼的毒性结果与其他受试生物相关性均不强(-0.301～0.090)。同时，5个污水处理厂的污泥对裸项栉鰕虎鱼仔鱼产生的毒性效应差别较小(LC50值都较小)，对于污泥样品毒性的区分度不佳，结果表明裸项栉鰕虎鱼仔鱼对污泥虽具有较高灵敏度但毒性筛分能力较差。

表4 受试生物LC50(EC50)的pearson相关性系数矩阵(n=5)Table 4 Pearson correlation coefficient matrix of LC50(EC50) values (n=5)

注：**为P<0.01；*为P<0.05。

Note: ** stands for P<0.01; * stands for P<0.05.

国内一些学者分析了阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)对裸项栉鰕虎鱼仔鱼(96 h)、卤虫(96 h)、蒙古裸腹溞(72 h)和脊尾白虾(96 h)的毒性，研究结果表明裸项栉鰕虎鱼仔鱼相比其他几种受试生物对于SDS具有更高的生物敏感性[37-39]，而国外学者研究发现早期阶段的鳉鱼对于氯酚类和多氯联苯类有机污染物的敏感性普遍较高[40-43]。因此，是否由于5个污泥的浸出液中可能存在一些低水溶性有机污染物，如具有遗传毒性的氯酚(CPs)、氯苯(CBs)、硝基苯(NBs)、多氯联苯(PCBs)、多氯代二苯并二噁英/呋喃(PCDD/Fs)、邻苯二甲酸酯(PAEs)和多环芳烃(PAHs)等[44]，又或者常见于生活污水中的水溶性有机污染物直链烷基苯磺酸钠(LAS)和SDS等，从而对裸项栉鰕虎鱼仔鱼产生较大毒性，推论有待进一步证实。

何芬等[45]以鱼类和发光细菌等作为受试生物进行的单一化学毒物对比研究则显示鱼类的灵敏度不如蚤类和发光细菌。该实验结果与本研究结果不一致的原因可能为受试鱼类的毒物耐受能力存在差距，或不同毒物化学特征和混合形式的差异所导致。本研究中，其他3种受试生物卤虫、蒙古裸腹溞和费氏弧菌在灵敏度和筛分能力上均较高，卤虫的LC50值低于费氏弧菌和蒙古裸腹溞，说明其灵敏度更高，这与国内学者利用卤虫研究污水污泥毒性获得的结论基本一致[5]。

综上分析，费氏弧菌的生物毒性效应与蒙古裸腹溞和卤虫有较高相关性，尽管卤虫兼具高筛分能力和高灵敏度的优点，但费氏弧菌具有更简便、快速和灵敏的特点，污水污泥毒性实验中可以优先考虑选择费氏弧菌作为受试生物替代蒙古裸腹溞和卤虫。毒性效应较特殊的裸项栉鰕虎鱼仔鱼可作为毒性结果评价一个补充参考项。

致谢：感谢国家海洋局南海环境监测中心陶伟、郑琰晶在文章撰写过程中给予的帮助。

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ToxicityofMunicipalSewageSludgetoMarineOrganisms

Lyu Xiangli, Wu Peng, Zhu Aijia, Ni Zhixin, Zhang Jinghuai, Chen Bin*

South China Sea Environmental Monitoring Center, SOA, Guangzhou 510300, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170216001

2017-02-16录用日期2017-05-05

1673-5897(2017)3-636-08

X171.5

A

陈斌(1988-)，女，硕士，助理工程师，主要研究方向为海洋分子生物学。

国家海洋局公益性科研项目子课题(201105010-2)；广东省自然科学基金项目(2014A030310495)；国家海洋局南海分局海洋科学技术局长基金(1431)

吕向立(1985-)，男，学士，研究方向为海洋生态毒理学，E-mail：xianglilyu@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: stlxbb@126.com

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