老年重症肌无力患者Treg、APO-1、RyR-Ab、干扰素-αAb、AchR-Ab的水平变化及意义

董礼全 刘艳萍 徐 东 彭忠民 马春燕 潘旭东

(威海市立医院神经内科，山东 威海 264200)

老年重症肌无力患者Treg、APO-1、RyR-Ab、干扰素-αAb、AchR-Ab的水平变化及意义

董礼全 刘艳萍 徐 东1彭忠民2马春燕3潘旭东4

(威海市立医院神经内科，山东 威海 264200)

目的探讨老年重症肌无力(MG)患者外周血Treg、APO-1、RyR-Ab、干扰素(IFN)-αAb、AchR-Ab的表达及意义。方法采用流式细胞术和酶联免疫吸附法(ELISA)测定MG患者和健康者Treg、APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb、AchR-Ab的表达情况。结果老年组外周血Treg明显低于非老年组(P<0.05)。老年组外周血APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb明显高于非老年组和健康对照组(P<0.05)。老年组外周血AchR-Ab明显高于健康对照组(P<0.05)，与非老年组无统计学差异(P>0.05)。MG患者RyR-Ab、IFN-αAb与年龄呈正相关，RyR-Ab与Oosterhuis评分呈正相关。结论老年MG患者与非老年患者免疫机制存在差异，检测老年MG患者免疫指标对临床判断病情有指导意义。

重症肌无力；调节性T细胞；APO-1；RyR-抗体；干扰素-α抗体

重症肌无力(MG)是一种自身免疫性疾病，有多种抗体和补体参与其发病。CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)作为一种免疫细胞在多种免疫性疾病中发挥作用，其一方面具有抑制存在于正常机体内潜在的大量自身反应性T细胞的活化与增殖的功能，另一方面有维持免疫耐受，抑制发生自身免疫病的功能。Treg起源于人类胸腺，而MG患者常伴胸腺异常，如胸腺增生、胸腺瘤等〔1〕。但Treg在MG中的具体作用机制尚不明确，它与发病、病情转归、患者年龄、性别、类型的关系均不明确。凋亡因子APO-1在多种免疫相关疾病中发生改变，国外学者发现MG患者Treg细胞存在APO-1高表达的情况〔2〕，国内尚未见类似报道。国外研究显示MG患者Ryanodine受体抗体(RyR-Ab)和干扰素-α抗体(IFN-αAb)异常〔3，4〕，国内研究甚少。MG有青年和老年两个发病高峰，老年患者男性多，伴有胸腺肿瘤多。国内外对老年MG的研究甚少，本研究利用流式细胞术和ELISA对MG患者外周血 Treg、APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb 进行同时测定，并探讨其意义。

1 资料和方法

1.1一般资料 87例MG患者中男41例,女46例，老年组(≥60岁)35例，男18例,女17例,年龄60～72(平均68.5)岁,病程1～25(平均15.9)个月。根据改良Osserman分型：Ⅰ型10例，Ⅱa型10例，Ⅱb型11例，Ⅲ型1例，Ⅳ型3例。根据Oosterhuis 5分评定法对肌无力严重程度评分，其中0分0例，1分10例，2分10例，3分11例，4分4例，5分0例。非老年组(<60岁)52例，男23例,女29例,年龄13～59(平均31.5)岁,病程1～21(平均14.3)个月。根据改良Osserman分型：Ⅰ型23例，Ⅱa型19例，Ⅱb型6例，Ⅲ型1例，Ⅳ型3例。根据Oosterhuis 5分评定法对肌无力严重程度评分，其中0分0例，1分23例，2分19例，3分6例，4分4例，5分0例。健康对照组30例，男12例,女18例，年龄20～76(平均42.2)岁。均排除神经系统及自身免疫系统疾病。

1.2实验材料 清晨空腹肘静脉采血5 ml，其中3 ml促凝，迅速分离出血清，置于-70℃保存备用，2 ml EDTA抗凝，6 h内流式细胞术检测。

1.3Treg及APO-1检测 EPICS XL-4型流式细胞仪进口于美国贝克曼公司，Optilyse C溶血素，小鼠抗人荧光单抗CD25-FITC、CD4-PE-Cy5及同型对照进口于法国Immunotech公司。小鼠抗人荧光单抗CD95-PE及同型对照购于晶美生物公司。抗体组合为CD25-FITC、CD95-PE、CD4-PE-Cy5。以FS-SS设门分析外周血Treg和APO-1的表达。

1.4RyR-Ab测定 参照Meis等〔5〕的方法，牛血清白蛋白购于美国Sigma公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体购于美国KPL公司。以大于健康对照组所测 A450的均值加上2倍标准差为RyR-Ab阳性。

1.5IFN-αAb测定 利用改良酶联免疫吸附法(ELISA)按照IFN-αAb试剂盒1R310(美国RB公司)说明书进行，测定波长450 nm处吸光度值。

1.6AchR-Ab的测定 操作过程参照文献〔6〕,结果判断：以正常对照组实际测得的AchR-Ab光密度(OD492 nm)均值+3SD以上者为阳性。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t检验或秩和检验，χ2检验及Spearman相关分析。

2 结 果

2.1各组外周血各指标比较 老年组外周血Treg明显低于非老年组(P<0.05)。老年组外周血APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb匀明显高于非老年组和健康对照组(P<0.05)。老年组外周血AchR-Ab高于健康对照组(P<0.05)，与非老年组无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组外周血Treg、APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb、 AchR-Ab水平比较

与老年组比较：1)P<0.05

2.2各指标相关性分析 MG患者RyR-Ab(r=0.454，P<0.01)，IFN-αAb与患者年龄呈正相关(r=0.485，P<0.01)。Treg(r=0.037,P=0.358)、APO-1(r=0.077,P=0.179)和AchR-Ab(r=0.136,P=0.557)与患者年龄不相关。RyR-Ab与Oosterhuis评分呈正相关(r=0.573，P<0.01)。Treg(r=0.170,P=0.173)、APO-1(r=0.093,P=0.231)、IFN-αAb(r=0.129,P=0.553)和AchR-Ab(r=0.071,P=0.218)与Oosterhuis评分无明显相关性。

3 讨 论

研究提示MG与老年男性胸腺瘤发病有关〔7〕，Treg具有免疫抑制功能，其特征性地表达CD25，可以分泌细胞因子白细胞介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β等。目前研究认为Treg主要通过对于自身抗原或同种异体抗原所激活的CD4+、CD8+T细胞有明确的抑制作用而发挥其免疫调剂功能〔8〕。本研究发现老年组外周血Treg明显低于非老年组。APO-1为分子量为45 kD的凋亡因子，属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族，一般表达于胸腺细胞、T、B细胞等表面。凋亡异常可能导致胸腺细胞、T、B细胞等免疫功能失控〔9〕。而本实验结果并没有发现APO-1与患者年龄及Oosterhuis评分相关，推测可能的原因是APO-1升高后与其配体结合而消耗，也可能与患者实际发病时段的具体病情有关。MG患者血清中还存在多种抗体？RyR是体内最重要Ca2+通道蛋白，可瞬间释放大量Ca2+而引起肌肉收缩〔10〕。本研究发现，老年组RyR-Ab明显高于非老年组和健康对照组，此抗体可阻止Ca2+通道蛋白开放。 RyR-Ab表达情况与Oosterhuis评分呈显著正相关，说明RyR-Ab在老年患者体内更高，并且对老年MG病情的评估有参考意义。IFN-α具有抗肿瘤作用，主要由白细胞产生〔11〕。IFN-αAb可中和IFN-α的抗肿瘤作用。IFN-αAb与患者年龄正相关。老年患者IFN-αAb增高可能与老年男性MG患者伴有胸腺瘤较多有关。IFN-αAb与Oosterhuis评分无明显相关性。MG患者体内存在细胞及体液免疫紊乱，老年MG患者Treg、APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb、AchR-Ab较高，其中只有RyR-Ab、IFN-αAb与患者年龄正相关，提示MG并非如脑血管病、变性病等年龄相关性疾病，老年患者标记物的升高提示MG在老年存在一个发病小高峰。这种发病率并非与年龄正相关，并且60岁以上中老年患者免疫记忆细胞敏感性高，容易形成抗体。而体内吞噬细胞功能相对减退，免疫复合物清除慢，也是抗体高的原因。

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7Diaz A,Black E,Joel D.Thymectomy in non-thymomatous myasthenia gravis of any benefit〔J〕.Cardiol Vasc Thorac Surg,2014;18:381-9.

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10Pappas A,George C.Wellman setting the pace for GI motility:ryanodine receptors and IP3 receptors within interstitial cells of Cajal.Focus on "Intracellular Ca2+release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal"〔J〕.Physiol Cell Physiol,2015;308:C606-7.

11Leoni P,Xu SW,Stock C,etal.TGF-β 1 suppresses IRF-1 expression in pulmonary fibroblasts and modulates its induction by IFN-α and IFN-γ〔J〕.Eur Respir,2011;38:p4586.

〔2016-04-23修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R746.1

A

1005-9202(2017)19-4882-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.088

山东省自然科学基金(No.Y2002C13)

1 山东大学附属山东省立医院神经内科 2 山东大学附属山东省立医院胸外科 3 山东大学附属山东省立医院中心实验室 4 青岛大学附属医院神经内科

潘旭东(1963-)，男，博士，主任医师，博士生导师，主要从事动脉硬化研究。

董礼全(1980-)，男，博士，主治医师，主要从事动脉硬化研究。