糖尿病脑病大鼠脑PET/CT显像、胰岛素样生长因子受体及葡萄糖转运蛋白4的表达

张 铎 孟 姮

(北华大学附属医院放射科，吉林 吉林 132011)

糖尿病脑病大鼠脑PET/CT显像、胰岛素样生长因子受体及葡萄糖转运蛋白4的表达

张 铎 孟 姮

(北华大学附属医院放射科，吉林 吉林 132011)

目的观察糖尿病脑病大鼠脑PET/CT显像、胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)及葡萄糖转运蛋白(GLUT)4的表达。方法采用链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠糖尿病模型，Morris 水迷宫试验筛选糖尿病脑病大鼠模型，正常对照组，糖尿病组(排除脑病)，糖尿病脑病组各随机选取8只，进行脑部PET/CT显像、免疫组化法检测脑组织IGF-1R及GLUT4表达。结果与正常对照组及糖尿病组比较，糖尿病脑病组大鼠标准摄取值(SUV)显著降低(P<0.01)；IGF-1R表达显著增高而GLUT4显著下降(P<0.01)。结论糖尿病脑病大鼠脑组织IGF-1R异常高表达，扰乱了脑部糖代谢的相关通路。

糖尿病脑病；PET/CT；胰岛素样生长因子1型受体；葡萄糖转运蛋白4

PET/CT是根据示踪原理，利用正电子放射核素标记的示踪剂来探测正常和异常组织生理和生化改变。PET/CT在癫痫、老年性痴呆、帕金森病等多种中枢神经系统疾病的诊断、治疗决策和疗效评价等方面有重要意义。本研究利用PET/CT检测糖尿病脑病大鼠模型脑部的糖代谢水平，并利用免疫组化方法检测糖尿病脑病大鼠海马区胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)及葡萄糖转运蛋白(GLUT)4的表达。

1 材料与方法

1.1一般资料 清洁级健康雄性Wistar大鼠，12周龄，体重200～250 g，购自吉林大学实验动物中心。购回后饲养条件：室温22℃～28℃，相对湿度40%～70%，每日12 h光照维持，昼夜循环，饲以蛋白质含量为21%的标准饲料块，自由饮水，分笼饲养。适应性饲养1 w确认健康无病后用于实验。

1.2主要试剂及仪器 链脲佐菌素(STZ，美国 Sigma 公司)，18F-FDG注射液(吉林省硅谷医院配制)，IGF-1R单克隆抗体、GLUT4单克隆抗体(英国Abcam公司),SABC免疫组化染色试剂盒，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司),柠檬酸，柠檬酸钠(天津化学试剂厂),PET/CT扫描仪(美国GE公司),LifeScan 血糖仪(美国强生),Morris水迷宫自动监控仪(中国科学院技术研究所)。

1.3糖尿病大鼠模型的建立 50只Wistar雄性大鼠，随机挑选10只为正常对照组，剩余40只为模型组，适应性喂养1 w，禁食12 h，将 STZ 溶于柠檬酸盐缓冲液(0.1 mmol/L，pH=4.6)制成 0.5%的溶液，按 65 mg/kg体重腹腔单次注射。3 d后尾静脉采血，检测大鼠空腹血糖(FPG)值，>16.7 mmol/L 视为糖尿病模型建立成功。共成模36只，未成模者剔除。糖尿病模型成模12 w后，采用Morris水迷宫实验检测糖尿病脑病模型是否建立成功。实验期间大鼠均喂标准饮食，自由觅水，此期间模型组死亡4只，考虑为血糖过高导致死亡。

1.4Morris水迷宫试验筛选糖尿病脑病大鼠模型 成模后12 w后，PET/CT扫描前5 d开始试验，前4 d为训练，每天上、下午各4次，每只大鼠每次训练2 min，将大鼠面向池壁随机从4个入水点放入水中，记录从入水到找到站台所用的时间作为测试成绩(逃避潜伏期)。如果大鼠在2 min内未找到平台，逃避潜伏期计为2 min，并由实验者将其牵引至平台上，停留30 s后，放回笼中休息30 min之后，开始下一次测试。第5天为测试期，记录逃避潜伏期。逃避潜伏期同正常对照组比较无统计学差异者，视为糖尿病组(排除脑病)，成模21只；同正常对照组比较，逃避潜伏期明显延长，且出现认知功能减退的视为糖尿病脑病者，成模11只。正常对照组，糖尿病组，糖尿病脑病组各从中随机选取8只，进行PET/CT的显像及免疫组化研究。

1.5糖尿病脑病大鼠PET/CT显像 根据大鼠体重注射造影剂18F-FDG 0.75 mCi/kg，注射30 min 后进行PET/CT显像。显像前采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，10 min以后，达到麻醉效果，昏睡状态，对手术刺激无明显反应，麻醉后仰卧固定。先采集CT定位像，电压80 kV，电流30 mA，球管旋转时间0.8 s，扫描层厚5 mm，重建层厚4.25 mm。随即采集PET图像，采集视野间的重叠数1，采集时间106 min。PET图像经OSEM重建，Xeleris工作站分别获得CT、PET及两者融合图像，检测大鼠脑部糖代谢情况。PET图像均经衰减校正处理。利用Xeleris图像融合工作站调用PET/CT断层图像，获得横断面数据，利用CT图像准确选取最大切面，在PET图像上，应用18F-FDG PET 检测大鼠脑部葡萄糖代谢情况，利用感兴趣区技术测定标准摄取值(SUV)。

1.6脑组织的处理及准备 PET/CT显像后，迅速剪开胸腔暴露心脏，经左心室进入升主动脉，同时剪开右心房，冰生理盐水洗净组织表面血液，冰盘上迅速断头取脑。取一侧脑组织 4%多聚甲醛固定过夜，进行免疫组化染色。

1.7免疫组化检测 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP法)，按试剂盒说明书检测IGF-IR及GLUT4的表达。

1.8统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 实验过程中，糖尿病组大鼠出现明显的多饮、多食、多尿及体重下降，色暗黄，后期精神较差，行动迟缓的症状。糖尿病脑病组除出现上述糖尿病组情况外，精神状态更差，行动更加迟缓。第13周时，同正常对照组比较，糖尿病组和糖尿病脑病组体重明显降低(P<0.01)，血糖值均明显升高(P<0.01)，见表1。

2.2行为学测试结果 第1天各组大鼠逃避潜伏期无统计学差异(P>0.05)，从第2～5天各组出现统计学差异(P<0.01或P<0.05)。同正常对照组相比，糖尿病组第4，5天逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，糖尿病脑病组第2天开始逃避潜伏期就明显延长(P<0.05,P<0.01)，与糖尿病组比较；糖尿病脑病组第4、5天逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。见表2。

2.3糖尿病脑病大鼠PET/CT显像 与正常对照组SUA(3.62±0.30)相比，糖尿病组大鼠SUV值降低趋势极为显著(2.11±0.25，P<0.01)；而糖尿病脑病组大鼠SUV具有同样趋势且更为显著(0.31±0.03，P<0.01)；糖尿病组与糖尿病脑病模型组比较SUV值也有显著差异(P<0.01)；说明与正常对照组比较，糖尿病大鼠葡萄糖代谢率明显下降，而糖尿病脑病大鼠葡萄糖代谢率下降更为明显。见图1。

表1 各组大鼠血糖、体重比较

与正常对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01；与糖尿病组比较：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

表2 各组大鼠在 Morris 水迷宫中到达平台的平均潜伏期比较

图1 各组大鼠PET/CT脑部糖代谢检测

2.4免疫组化检测 同正常对照组相比，糖尿病脑病组IGF-1R含量明显增多，而糖尿病组IGF-1R含量少于正常对照组。见图2。同正常对照组相比，糖尿病脑病组GLUT4含量明显减少，而糖尿病组GLUT4含量明显增多。见图3。

图2 各组大鼠脑组织IGF-1R的表达(DAB，×40)

图3 各组GLUT4的表达(DAB，×40)

3 讨 论

由于Wistar大鼠具有多样的行为表现，灵敏的情绪反应，适应能力强，探索性强，神经系统反应方面与人有相似性等特点，故被广泛应用于学习和记忆能力等行为学测试研究〔1，2〕。对于STZ的剂量，50～70 mg/kg体重均有使用，国内外报道并不一致〔3～5〕。本实验选用65 mg/kg，成模率较高。

PET/CT是目前临床应用最广泛的分子影像学检测方法之一，不仅可以清晰地显示出躯体或器官的解剖结构，而且还可以精细地描绘出机体分子水平上的生理病理和生物代谢过程〔6〕。PET/CT 目前在临床上主要应用在神经系统疾病、肿瘤和心血管系统疾病等〔7〕。PET/CT具有极高的敏感度，在糖尿病脑病出现结构改变之前，即可发现其功能性改变，确定局部脑葡萄糖代谢率及脑功能状态异常，对于早期发现和诊断糖尿病脑病具有较大的价值。

胰岛素受体(IR)位于细胞膜上，为四聚体结构，包括两条α链、两条β链及中间的二硫键。靶细胞膜上IR的α亚基与胰岛素相结合，引起IR的构象改变，α亚基对β亚基抑制去除，使β亚基上的酪氨酸残基发生磷酸化反应，导致下游的信号蛋白被依次激活，从而促使GLUT4移位，介导葡萄糖由外向内转运，调节细胞内能量代谢。IR在脑内的分布非常广泛，海马、嗅球、下丘脑等与学习、记忆和认知功能相关的大脑区域表达丰富〔8〕。中枢神经系统胰岛素/胰岛素受体信号系统的正常运行是维持大脑血液运行和能量代谢正常进行的关键因素〔9〕，如该系统发生障碍，则易出现认知功能障碍及一系列病理生理改变。

研究表明，GLUT4在脑内亦是选择性表达的，例如在大鼠海马、感觉运动区皮层、垂体后叶和下丘脑中均可见表达，尤其在海马组织中表达量丰富〔10～12〕，其在脑内的选择性表达可能与胰岛素刺激这些脑区对葡萄糖的摄取有关。葡萄糖是哺乳类动物大脑能量代谢的主要原料〔13〕，因其亲水的特性，它不能通过脂质双层，但葡萄糖通过细胞膜是细胞产生能量的前提基础，这一过程主要是通过GLUT4介导完成的〔14〕。GLUT4在脑组织能量代谢过程中的作用则显得更为重要，其表达水平能反映脑组织细胞对葡萄糖的需求程度〔15〕。本实验结果显示，IGF-1R与GLUT4在糖尿病脑病的发生发展过程中起着更为重要的作用。

1Duarte JM,Nogueira C,Mackie K,etal.Increase of cannabinoid CB1 receptor density in the hippocampus of streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Exp Neurol,2007;204(1):479-82.

2Lin YH,Westenbroek C,Tie L,etal.Effects of glucose,insulin,and supernatant from pancreatic beta-cells on brain-pancreas relative protein in rat hippocampus〔J〕.Neurochem Res,2006;31(12):1417-24.

3Chang HK,Mukes JD,Figgers CL.Ameliorative effects of dietary caloric restriction on oxidative stress and inflammation in the brain of streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Am J Chin Med,2004;32(4):497-507.

4Ugochukwu NH,Bady NE.The effect of Gongronema latifolium extracts on serum lipid profile and oxidative stress in hepatocytes of diabetic rats〔J〕.J Biol Sci,2006;370(12):165-73.

5Elangovan V,Kohen R,Shohami E.Neurological recovery from closed head injury is impaired in diabetic rats〔J〕.J Neurotranma,2000;17(11):1013-27.

6Dunphy MP,Lewis JS.Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET〔J〕.J Nucl Med,2009;106S-121S.

7Vallabhajosula S.Molecular imaging:radiopharmaceuticals for PET and SPECT〔M〕.Berlin:Heidelberg,2009:201-8.

8Thomas T,Thomas G,Mclendon C,etal.β-amyloid-mediated vasoactivity and vascular endothelial damage〔J〕.Nature,1996;380:168-71.

9Dong XC,Park S,Lin XY.Irs1 and Irs2 signaling is essential for hepatic glucose homeostasis and systemic growth〔J〕.J Clin Invest,2006;1:32-6.

10Kobayashi M,Nikami H,Morimatsu M,etal.Expression and localization of insulin regulatable glucose transporter(Glut4)in rat brain〔J〕.Neurosci Lett,1966;213:103-6.

11Messari SE,Leloup C,Quignon M,etal.Immunocytochemical localization of the insulin regulatable glucose transporter(Glut4)in the central nervous system〔J〕.J Comp Neurol,1998;399:492-512.

12Vannucci SJ,Koehler-Stec EM,Li K,etal.Glut4 glucose transpoter expression in rodent brain effects of diabetes〔J〕.Brain Res,1998;797:1-11.

13Pardride WM.Brain metabolism:a perspective from the blood-brain barrier〔J〕.Physiol Rev,1983;63:1481-535.

14Mcewen BS,Reagen LP.Glucose transporter expression in the central nervous system:relationship to synaptic function〔J〕.Eur J Pharmacol,2004;490:13-24.

15Steen E,Terry BM,Rivera EJ,etal.Impaired insulin and insulin-like growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer’s disease is this type diabetes〔J〕.J Alzheimer Dis,2005;7:63-80.

〔2016-02-04修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R589

A

1005-9202(2017)19-4747-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.024

教育部博士基金项目(No.200801830071)

孟 姮(1968-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事神经影像学研究。

张 铎(1970-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事神经影像学研究。