辛伐他汀对COPD大鼠肺组织血红素氧化酶-1及炎性因子表达的影响

朱 勇 赵华栋 魏东阳 崔建娇

(锦州医科大学附属第三医院重症医学科，辽宁 锦州 121000)

辛伐他汀对COPD大鼠肺组织血红素氧化酶-1及炎性因子表达的影响

朱 勇 赵华栋 魏东阳 崔建娇1

(锦州医科大学附属第三医院重症医学科，辽宁 锦州 121000)

目的探讨辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织血红素氧化酶(HO)-1表达的影响。方法24只SD大鼠按随机数字表法分为3组，每组8只。对照组：第1、15天气管内滴入生理盐水0.2 ml，其余时间正常喂养；烟雾暴露组：第1、15天气管内滴入脂多糖0.2 ml，将8只大鼠放进大鼠吸烟装置染毒箱内COPD建模；辛伐他汀组：建立COPD模型方法同上，每次熏烟结束后，给予辛伐他汀灌胃治疗(5 mg/kg)，置于相同的环境中喂养。右心导管测定大鼠平均肺动脉压(mPAP)，以右心室肥厚指数(RVHI)作为评价右心室肥厚的指标。苏木精-伊红(HE)染色检测大鼠肺组织病理学变化。实时定量PCR(RT-PCR)方法测定肺组织HO-1 mRNA的表达，通过Western印迹及免疫组织化学方法检测肺组织HO-1蛋白的表达。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平。结果辛伐他汀组mPAP较烟雾暴露组下降，烟雾暴露组较对照组升高(P<0.05)。辛伐他汀组RVHI较烟雾暴露组下降(P<0.05)。辛伐他汀组镜下观察气管壁增厚，管腔变窄且肺动脉壁增厚，但是较烟雾暴露组减轻。免疫组织化学实验结果显示，辛伐他汀组肺动脉平滑肌细胞、内皮细胞膜上出现的棕黄色颗粒最多。辛伐他汀组HO-1 mRNA是对照组的(7.26±2.11)倍。烟雾暴露组大鼠HO-1表达增强，辛伐他汀治疗后表达进一步增强。在BALF中，IL-6和TNF-α在辛伐他汀组、烟雾暴露组较对照组表达增加(P<0.05)。辛伐他汀组、烟雾暴露组均较对照组血清IL-6表达增加(P<0.05)，TNF-α 在辛伐他汀组、烟雾暴露组较对照组表达增加(P<0.05)，辛伐他汀组中TNF-α表达量较烟雾暴露组降低(P<0.05)。结论辛伐他汀能够促进COPD表达HO-1，减轻COPD炎症反应，改善COPD的发生发展及预后。

慢性阻塞性肺疾病；吸烟；血红素氧合酶-1；辛伐他汀

血红素氧化酶(HO)-1具有抗感染、抗氧化损伤等生理功能〔1〕，是一种保护性和适应伤害性刺激反应，常表达于肺、心等器官组织〔2〕，基因表达的调控主要发生在转录水平〔3〕。慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有高致残率和病死率，降脂类药物辛伐他汀能够减少心血管疾病的病死率和发病率〔4〕，但对呼吸系统的影响尚无定论。HO-1是诱导酶，可受多种因素诱导产生，在肺内被应激因素刺激后表达。本研究通过烟熏法复制COPD模型，观察辛伐他汀对COPD大鼠肺功能的影响及HO-1在COPD中发挥的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料 辛伐他汀(常州九天医药公司，生产批号：20070901)；哈德门牌香烟(山东中烟工业公司，标示：焦油含量13 mg，烟碱量为1.2 mg，烟气一氧化碳量为15 mg)；HO-1免疫组化测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司，中国)；大鼠吸烟装置(JY-01型)(石家庄绵阳科技开发有限公司，中国)；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，中国)；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒96T，大鼠白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒96T(南京建成赛浩科技有限公司，中国)。健康雄性SD大鼠24只(中国医科大学实验动物中心，许可证号1501003)，体重(100±9)g，由中国医科大学实验动物中心SPF级饲养，饲料和水严格灭菌。

1.2方法

1.2.1分组与模型制作 大鼠经1 w适应喂养后，24只大鼠按随机数字表法分为3组，每组8只。对照组：第1、15天气管内滴入生理盐水0.2 ml，其余时间正常喂养；烟雾暴露组：第1、15天气管内滴入脂多糖0.2 ml，将8只大鼠放进大鼠吸烟装置染毒箱内，箱上端有两个(1.5 cm×1.5 cm)小孔与外界相通，防止动物缺氧，香烟去掉过滤嘴后插入染毒箱中点燃，关闭染毒箱，1 h后取出大鼠，休息12 h后再重复以上操作1次，连续熏烟5 w，每次熏烟结束后，将烟雾暴露组置于和对照组相同的环境中喂养饲料。辛伐他汀组：建立烟雾暴露组COPD模型方法同上，每次熏烟结束后，给予辛伐他汀灌胃治疗(5 mg/kg)，置于相同的环境中喂养。

1.2.2平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥厚指数测定(RVHI)与血清、支气管肺泡灌洗液采集 实验第5周，熏烟结束后，首先将各组大鼠用天平称重，然后利用腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，后仰卧位固定，分离腹主动脉，抽取动脉血3 ml，于2 000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存。将0.9 mm的聚苯乙烯管进入右心房、右心室(RV)、肺动脉，利用压力换能器与多导生理记录仪测定mPAP。mPAP测定结束后，通过股动脉缓慢放血处死大鼠，开胸暴露肺和心脏，对大鼠肺部结扎右主支气管，于隆突上用套管针穿刺至左肺，然后用2 ml生理盐水进行灌洗3次，回收率约为80%，支气管肺泡灌洗液(BALF)4℃ 1 000 r/min 离心10 min，上清液-20℃保存，沉淀用0.5 ml生理盐水混匀后编号待检。进行瘀血清理和冲洗后，完整的取下大鼠心脏，沿室间隔分离RV、左心室加室间隔(LV+S)，分别称重，以RV/(LV+S)的质量比(RVHI)作为评价右心室肥厚的指标。利用生理盐水进行肺血管冲洗，以无菌棉签分出各个肺叶，肺叶用生理盐水冲洗后放入冷冻管置于液氮中储存处理及另一个肺叶放入装有甲醛的广口瓶中。

1.2.3大鼠肺组织苏木精-伊红(HE)染色 10%中性甲醛固定大鼠肺组织72 h，脱水、石蜡包埋连续切片，脱蜡至水，蒸馏水浸泡后，苏木素染色，1%盐酸酒精分色浸泡，伊红溶液染色，乙醇脱色，二甲苯透明。应用中性树胶封片，置于玻片架上自然烘干，置于显微镜图像处理系统(中国医科大学BHEC)下观察，应用显微镜(日本Olympus)采集图片。

1.2.4采用免疫组化方法检测大鼠肺组织中HO-1蛋白的表达 多聚-L-赖氨酸溶液内浸泡处理载玻片，干后存放于干燥避光的条件下备用。取固定48 h的肺叶，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，经过脱蜡至水，灭活内源性过氧化物酶，3% H2O237℃孵育10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min，然后进行抗原修复，置0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)中煮沸(95℃，15 min)，自然冷却20 min以上，冷却至室温，PBS冲洗5 min。滴加山羊血清后于37℃恒温箱中放置40 min。滴加一抗(兔抗人lgG，北京达科为生物科技有限公司)，置于4℃冰箱中过夜。加入生物素化二抗，置于37℃恒温箱中30 min。DAB溶液滴加显色，苏木素复染。脱水、透明，并用中性树胶封片。以上洗片用PBS缓冲液中浸洗5 min/次，共3次。显微镜下观测。判断标准：参与表达的平滑肌细胞胞膜上呈现出棕黄色颗粒，表达和颜色呈正比；而平滑肌细胞膜上无棕黄色颗粒出现，则说明表达为阴性。

1.2.5HO-1 mRNA在大鼠肺组织中的表达 利用消毒的陶瓷研磨器加液氮研磨取大鼠肺组织100 mg，粉末状后收集到灭菌的EP管中，向其中加入1 ml Trizol裂解液。按照Trizol试剂说明书提取组织的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA,进行荧光定量 PCR。HO-1 mRNA引物序列：HO-1上游引物：5′-TGT CCC AGG ATT TGT CCG AG-3′，下游引物： 5′-ACT GGG TTC TGC TTG TTT CGC T-3′，产物长度：118 bp；β-actin上游引物：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′,下游引物：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′，产物长度：153 bp。采用Trizol一步抽提法提取总RNA，20 μl体系中进行逆转录，25 μl体系中进行扩增。反应条件:95℃预变性30 s,95℃ 5 s,60℃退火20 s,72℃延伸60 s。HO-1和β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。取23 μl的反应体系和相对应的cDNA，按顺序放入到荧光定量PCR检测分析仪(ABI 7700，美国)中，进行荧光定量分析。以β-actin作为内参计算HO-1 mRNA的表达量，以2-△△CT表示。实验3个平行孔。

1.2.6Western印迹检测大鼠肺组织HO-1的表达 取出液氮中保存的大鼠肺组织，4℃解冻后组织匀浆；按匀浆后组织体积∶裂解液的比例为1∶5加入裂解液，加入蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂；按照二喹啉甲醛(BCA)试剂盒说明书求测定蛋白液浓度，以总蛋白质量为50 μg计算所需蛋白样本体积及10 μl上样体系中待补充的PBS和5倍蛋白上样缓冲液，配置好的蛋白上样体系在100℃下加热5 min；通过十二烷基硫酸钠-聚两烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，分离胶10%、浓缩胶5%)分离蛋白，分离胶电压80 V，浓缩胶120 V；转膜至聚偏氟乙衡(PVDF)膜(millipore公司)，电压100 V 60 min；用Tris盐酸缓冲液(TBST)清洗膜3次×10 min，然后加入封闭液(含5%胎牛血清的TBST液)中，37℃封闭60 min；加一抗，兔抗鼠多克隆HO-1(1∶100)，4℃摇晃过夜。次日TBST洗膜3次×10 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育90 min。取出膜后，TBST洗膜3次×10 min，ECL plus化学发光显色(赛默飞，美国)，天能发光系统TIF保存文件，Image-J图像软件系统分析。内参选用β-actin。

1.2.7检测BALF和血清IL-6、TNF-α水平及BALF中的白细胞数 本实验采用大鼠TNF-α ELISA试剂盒96T，大鼠IL-6 ELISA试剂盒96T测定血清、BALF中 IL-6、TNF-α水平，提前40 min将试剂盒从4℃冰箱中取出，置于室温下(约14℃)，血清、BALF标本从-20℃冰箱中取出室溫下融化。各步骤严格按照试剂使用说明书进行操作，酶标仪读取数据(Thermo Scientific，美国)。取与生理盐水混匀后的BALF沉淀，置于血球计数仪(Thermo Scientific，美国)计数BALF中白细胞数量。

1.3统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠基本指标比较 在烟雾暴露实验前三组〔对照组(108.0±9.0)g，烟雾暴露组(108.0±8.0)g，辛伐他汀组(113.0±6.0)g〕大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)；烟雾暴露实验结束后，辛伐他汀组大鼠体重〔(447.0±15.0)g〕低于对照组〔(491.0±11.0)g，P<0.05〕，烟雾暴露组〔(447.0±15.0)g〕也低于对照组(P<0.05)。辛伐他汀组大鼠mPAP〔(22.24±0.80)mmHg〕高于对照组〔(15.21±1.00)mmHg，P<0.05〕，烟雾暴露组〔(29.44±1.00)mmHg〕也高于对照组(P<0.05)。辛伐他汀组大鼠RVHI(0.24±0.04)高于对照组(0.22±0.04)(P<0.05)，烟雾暴露组(0.29±0.05)也高于对照组(P<0.05)。

2.23组大鼠肺组织HE染色 对照组肺泡及气管壁轮廓清晰，肺动脉壁未见增厚。烟雾暴露组肺泡扩张，炎症浸润，血管壁增厚，气管壁较对照组增厚，管腔变窄，并且肺动脉壁增厚。辛伐他汀组血管狭窄减轻，肺泡扩张降低，气管壁增厚，管腔变窄，并且肺动脉壁增厚，但是较烟雾暴露组减轻。见图1。

图1 3组大鼠肺组织的病理变化(HE，×400)

2.33组大鼠肺组织中HO-1的表达 辛伐他汀组肺动脉平滑肌细胞、内皮细胞膜上出现的棕黄色颗粒最多，烟雾暴露组比对照组多。见图2。

2.43组大鼠肺组织中HO-1 mRNA表达 辛伐他汀组HO-1 mRNA(7.26±2.11)高于烟雾暴露组(2.02±1.66，P<0.05)，烟雾暴露组表达高于对照组(1.00±0.00，P<0.05)。

2.5Western印迹检测大鼠肺组织中的HO-1 烟雾暴露组大鼠肺组织中HO-1蛋白表达较对照组增加，辛伐他汀治疗后表达明显增加。见图3。

图2 3组大鼠肺组织中HO-1的表达(IHC，×400)

图3 Western印迹检测HO-1在COPD大鼠肺组织的表达

2.6BALF和血清中IL-6、TNF-α水平及BALF中的白细胞数 在BALF中，辛伐他汀组、烟雾暴露组IL-6和TNF-α水平较对照组表达增加(P<0.05)。辛伐他汀组、烟雾暴露组血清中IL-6、TNF-α水平均高于对照组(P<0.05)，辛伐他汀组TNF-α表达量低于烟雾暴露组(P<0.05)。辛伐他汀组BALF中白细胞数为(0.86±0.23)×109/L，与对照组〔(0.65±0.38)×109/L〕比较差异显著(P<0.05)，烟雾暴露组〔(3.03±1.38)×109/L〕较对照组明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 BALF和血清中IL-6、TNF-α的水平

3 讨 论

COPD主要由遗传因素、气道高反应等个体易感因素和吸烟、空气污染等环境因素导致，其中吸烟为最主要的环境致病因素〔4〕。目前COPD常规治疗中激素类药物的使用可以缓解患者慢性炎症反应，但是全身性激素应用的严重副作用及吸入性激素使用的局限性导致其治疗效果有限〔5〕。研究显示，他汀类药物在除调脂作用外，还有抗氧化和抗感染等功效〔6〕。

本研究结果显示烟雾暴露组mPAP、RVHI明显高于对照组，肺动脉壁增厚，应用辛伐他汀组的mPAP、RVHI明显下降，肺动脉壁增厚减轻，这是由于他汀类药物是通过抑制异戊二烯类的合成，增加内皮型一氧化氮合酶合成，减少其灭活。研究显示，适量的HO-1在COPD中发挥保护作用〔7〕，其在发热、应激等状态刺激下，使内源性一氧化碳产量升高，提高了机体的应激能力。本研究发现，从烟雾暴露组开始，辛伐他汀组的肺动脉平滑肌细胞、内皮细胞膜上出现的棕黄色颗粒增加最为明显，发现辛伐他汀组HO-1的表达多于烟雾暴露组。HO-1 mRNA在烟雾暴露组较对照组表达增高，而辛伐他汀组HO-1 mRNA更高。推测可能是因为在烟雾暴露组COPD模型中，经过烟雾及脂多糖等外界因素的刺激，发生应激反应，出于机体自身的免疫机制，HO-1开始增多，最后产生适应性和保护性的反应，在辛伐他汀组，HO-1升高更加明显，可能是因为HO-1途径是辛伐他汀产生作用的关键通道，发挥自身抗炎症、抗增殖等作用，从而对COPD产生治疗作用〔8〕。

COPD的主要发病机制之一是肺及全身慢性炎症反应，本研究推测辛伐他汀对于COPD还具有抗感染作用，能够减轻COPD大鼠全身炎症反应。TNF-α具有较强的抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及炎症诱导作用。IL-6主要由单核-巨噬细胞分泌，具有多种活性的炎症细胞因子，能够调节免疫应答、参与炎症反应的功能，但在病理状态下，其水平的增高可以引起一系列的病理损伤。本研究结果说明起到了有效地抗感染作用。Loukides等〔9〕研究表明，降低全身炎症程度能改善COPD自然进程及预后，同本研究结果一致。

1穆 珺,庄晓明.血清血红素氧化酶-1水平与糖调节受损及其动脉粥样硬化的相关性研究〔J〕.中国糖尿病杂志,2015;23(10):881-4.

2Lee SE,Yang H,Son GW,etal.Crotonaldehyde-exposed macrophages induce heme oxygenase-1 expression as an adaptive mechanism〔J〕.Mol Cell Toxicol,2015;11(2):167-74.

3Lim HS,Jin S,Yun SJ,etal.Modulation of melanogenesis by heme oxygenase-1 via p53 in normal human melanocytes〔J〕.Chonnam Med J,2016;52(1):45-52.

4陈婉华,周伟成,黄锦伦,等.辛伐他汀联合运动训练治疗COPD稳定期合并代谢综合征患者的临床研究〔J〕.现代生物医学进展,2016;16(23):4508-11.

5Matera MG,Cardaci V,Cazzola M,etal.Safety of inhaled corticosteroids for treating chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Exp Opin Drug Saf,2015;14(4):533-41.

6Keskiväli T,Kujala P,Visakorpi T,etal.Statin use and risk of disease recurrence and death after radical prostatectomy〔J〕.Prostate,2016;76(5):469-78.

7徐 冰,张一兵.慢性阻塞性肺病大鼠血红素加氧酶-1表达及其临床意义〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(9):2353-5.

8Zhao W,Song H,Huo W.Long-term administration of simvastatin reduces ventilator-induced lung injury and upregulates heme oxygenase 1 expression in a rat model〔J〕.J Surg Res,2015;199(2):601-7.

9Loukides S,Bartziokas K,Vestbo J,etal.Novel anti-inflammatory agents in COPD:targeting lung and systemic inflammation〔J〕.Curr Drug Targets,2013;14(2):235-45.

〔2017-03-26修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

R692

A

1005-9202(2017)19-4742-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.022

辽宁省科学技术计划项目(No.2015020355)

1 锦州医科大学附属第三医院医学检验中心

崔建娇(1972-)，女，硕士，副主任检验师，主要从事临床检验研究。

朱 勇(1971-)，男，硕士生导师，副主任医师，主要从事重症医学研究。