鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法的建立及初步应用

刘志科，李村院，张秋雨，刘 洋，马亚茹，王月丽，陈创夫*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832003；3.河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003)

鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法的建立及初步应用

刘志科1△，李村院2△，张秋雨3，刘 洋1，马亚茹1，王月丽1，陈创夫1*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832003；3.河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003)

为了建立一种快速、高效和简便的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法，根据沙门菌侵袭蛋白基因invA的高度保守区域，利用Primmer 5.0软件设计2对特异性的套式引物，以提取的沙门菌DNA为模板克隆invA基因，将其连入T载体并计算拷贝数作为套式PCR的模板，在对反应条件进行优化的基础上，建立最佳的套式PCR反应条件，确定其上、下游引物用量分别为0.3 μL，套式PCR的第1次退火温度为57.4℃，第2次为53.5℃。应用该方法对已构建好的不同浓度的标准阳性质粒作为模板进行检测，其灵敏度为102拷贝数/20 μL，远高于常规PCR的106拷贝数/20 μL。用建立的套式PCR方法对从新疆石河子某鸡场采集的25样品进行检测，与传统的诊断方法比较符合率达95.00%。建立的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法具有快速、可行、特异性强、准确率高等特点，为鸡沙门菌病的早期诊断和研究提供了技术支撑。

鸡白痢沙门菌；套式PCR；常规PCR；invA基因；灵敏性

沙门菌是一种寄生在人和多种动物肠道内的革兰阴性菌，是一种重要的人畜共患病病原。鸡白痢沙门菌病是一种急性败血性疾病，多危害20日龄以内的雏鸡，患病鸡表现为白痢、高病死率；成年鸡主要是生殖器官感染，多数呈隐性局部炎症，并通过卵黄内带菌传播给雏鸡[1]。沙门菌不但能引起多种畜禽疾病，还会污染食物及引起人食物中毒，严重危害人类健康，世界卫生组织(WHO)将沙门菌列入了具有严重危害和中等危害的食物传播性病原。

当前鸡白痢沙门菌病的诊断主要根据沙门菌属的培养特性、生化试验和血清学试验，这些传统方法步骤比较繁琐、费时费力，已不能满足当前快速诊断的需求。由于沙门菌属的血清型比较多，有2 500种以上，所以建立一种快速、高效、准确的检测方法，对于沙门菌病的诊断具有重要意义。国内外已经建立了斑点免疫金渗滤法、免疫荧光标记法、恒温核酸扩增技术及荧光定量PCR方法，但由于试验所需条件比较高，仪器昂贵，并不适合在基层推广和应用[2]。根据鸡白痢沙门菌的传播特点，利用已经建立的PCR技术可以检测出极微量的病原菌，这种方法在雏鸡沙门菌病检疫方面的应用越来越广泛，但其敏感性和特异性没有一个通用和严谨的判定标准，存在一些不足之处。而套式PCR是在原有的PCR技术上又增加了一条引物，其灵敏性比常规PCR要高很多[3]。但目前这个技术在检测沙门菌方面并不是太完善，报道也比较少。本研究对鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法的体系和条件进行优化和改善，进一步验证其敏感性、特异性和重复性，并初步应用建立的检测方法对临床样品进行检测，为沙门菌快速检测提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器 快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，康为世纪生物公司产品；DH5α感受态细胞、2×ESTaqMasterMix、T-vector PMD19、细菌基因组DNA提取试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒、IGTP/X-gal，Tiangen公司产品；LTD、沙门菌成套生化鉴定管，青岛博海生物技术有限公司产品；PCR仪，Eppendorf公司产品；紫外凝胶成像分析系统，Molecular Imager公司产品；高速离心机，德国Sigma公司产品；核酸蛋白检测仪，美国Thermo Scientific公司产品。

1.1.2 菌株及临床病料 鸡白痢沙门菌(CVCC530)购于中国兽医药品检查所；其他对照菌(多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、李斯特菌和放线杆菌)均由石河子大学微生物教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 invA基因编码沙门菌的一种侵袭蛋白，决定细菌进入动物上皮细胞的能力，与致病性密切相关。根据GenBank公布的鸡白痢沙门菌invA基因(登录号：NC003197.1)保守区核苷酸序列，利用Preimer5.0，设计3对引物，并用DNA Man进行基因同源性分析。克隆引物invAK，套式PCR内外引物分别为invAW和invAN，具体引物序列见表1。引物由上海Sangon Biotech公司合成。

表1 引物信息

1.2.2 重组质粒制备

1.2.2.1 目的基因扩增与重组质粒的构建 用DNA提取试剂盒提取鸡白痢沙门菌的DNA作为模板，用克隆引物 (invAK) 进行常规PCR扩增invAK基因的片段。反应结束后，PCR产物以170 V、120 mA在10 g/L的琼脂糖凝胶电泳来验证分析。用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带。与pMD19-T载体过夜连接，重组质粒转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，通过IPTG/X-gal筛选阳性克隆菌，PCR验证正确后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.2.2 质粒的提取、鉴定及定量 按照高纯度质粒小提试剂盒的说明书进行质粒的提取，用核酸蛋白检测仪测定其质粒浓度，提取质粒OD 260/OD 280的比值在1.8～2.0范围时，说明提取质粒纯度高、杂质较少[4]，根据公式计算出重组质粒的拷贝数。

拷贝数﹦质粒浓度(ng/μL)×10-9/重组质粒分子质量×6.022×1023

1.2.3 最佳引物用量的确立 分别将invAW和invAN的上、下游引物稀释至20 μmol/L,分别取 0.2、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6 μL，以106拷贝/μL的重组质粒标准品为模板，采用常规PCR方法进行扩增，筛选出引物的最优反应浓度。

1.2.4 PCR反应体系 以106拷贝/μL鸡白痢沙门菌标准株重组质粒的为模板，第1轮PCR反应体系20 μL，包括ddH2O 8.2 μL，上、下游引物 invAWF、invAWR 0.3 μL，模板1.5 μL，2×ESTaqMasterMix 10 μL；第2轮PCR反应体系20 μL：ddH2O 8.7 μL，上、下游引物 invANF、invANR 0.3 μL，模板1 μL，2×ESTaqMasterMix 10 μL ,第2轮PCR反应模板为第1轮PCR反应的胶回收产物。

1.2.4.1 退火温度的优化 第1轮PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，57.4℃～59℃ 30 s，30个循环；72℃ 50 s。第2轮PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，53.5℃ 30 s，35个循环；72℃ 30 s。经30 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。将长度为278 bp的目的DNA片段切下后，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收。最后，取8 μL的PCR产物进行凝胶电泳和测序验证。

1.2.4.2 灵敏性和特异性分析 将质粒按10倍梯度稀释成不同的拷贝数，建立标准曲线，分别以1010、109、108、107、106、105、104、103、102、10拷贝/μL为模板，进行套式PCR扩增，确定方法的灵敏度。利用本试验优化的套式PCR反应程序，对已知阳性菌和5株非目标菌进行检测，验证所建立的套式PCR方法检测鸡白痢沙门菌的特异性。

1.2.4.3 重复性试验 选择浓度为10、105、107拷贝/μL的invA基因阳性质粒进行套式PCR扩增，分别进行批内和批间重复性试验，对每个拷贝数模板进行3个平行重复；同时，对批间中的105的稀释拷贝数的阳性质粒作为批内检测，共复检3次，根据琼脂糖凝胶电泳结果确定方法的重复性。

1.2.4.4 临床样品检测 在新疆石河子某鸡场采样，利用沙门菌成套生化鉴定管对采集的25份样品进行鉴定，共检出20份阳性样品和5阴性样品，用DNA提取试剂盒提取样本的DNA。以阳性质粒为对照组，用本研究建立的鸡沙门菌套式PCR方法进行检测，来比较常规PCR扩增方法与套式PCR方法准确性。

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增及测序结果

以鸡白痢沙门菌的DNA为模板，利用克隆引物invAK进行PCR扩增目的条带，经琼脂糖凝胶电泳显示条带大小为1 143 bp(图1)。送到公司测序并对结果进行比对，扩增的目的片段序列与原始序列的同源性一致。

M.DNA 标准 DL 5 000；1.PCR产物

M.DNA Marker DL 5 000；1.PCR product

图1 invA基因PCR结果电泳图

Fig.1 Electrophoresis of invA gene PCR result

2.2 重组质粒标准品的鉴定

对获得的阳性质粒进行PCR验证，扩增出625 bp条带，与鸡白痢沙门菌为模板进行PCR反应所得到的片段大小相同。测序结果显示,连接片段的序列和目的基因序列同源性为100%，表明成功构建了重组质粒。提取重组质粒，并将质粒浓度稀释至1010拷贝/μL,再依次进行10倍梯度稀释为1010、109、108、107、106、105、104、103、102、10拷贝/μL，作为套式PCR的标准品，置-20℃保存备用。

2.3 套式PCR检测方法的建立

2.3.1 最佳引物用量的确立 分别取不同体积浓度20 μmol/L的引物，进行PCR扩增。结果发现，当上下游引物的体积各为0.3 μL时，对重组质粒的检测可以获得最优的条带(图2)。

2.3.2 退火温度的优化 对套式PCR的第1轮退火温度设计梯度，结果表明最适退火温度为57.4℃(图3)。

2.3.3 灵敏性和重复性试验 分别以100～1010拷贝/μL的标准品为模板，用设计的外引物(invAWF和invAWR)进行套式PCR的第1次扩增，在106拷贝/μL时能检测出条带，常规PCR方法在20 μL体系中最低检出的下限为106拷贝/μL(图4)。用上述的PCR反应产物作为第2轮PCR扩增的模板，用设计的内引物(invANF和invANR)进行第2轮扩增，结果显示，套式PCR在模板浓度为102拷贝/μL就可用扩增到目的条带，比常规PCR灵敏性提高10 000倍(图5)。106拷贝/μL质粒为模板进行3次重复性试验(图6)。结果显示，鸡白痢沙门菌invA基因建立的套式PCR的灵敏度较高、重复性好。

M.DNA 标准 DL 2 000；1～6.引物体积用量为0.2 μL、0.1 μL、0.3 μL、0.4 μL、0.5 μL、0.6 μL

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.primer volumes as 0.2 μL,0.1 μL,0.3 μL,0.4 μL,0.5 μL and 0.6 μL

图2常规PCR最佳引物体积分析

Fig.2 Optimal primer volume analysis of conventional PCR

M.DNA 标准 DL 2 000 ;1～7.退火温度分别是57.4℃、57.7℃、58℃、58.3℃、58.6℃、58.9℃、59.2℃

M.DNA Marker DL 2 000;1-7. The annealing temperatures as 57.4℃，57.7℃，58℃，58.3℃，58.6℃，58.9℃ and 59.2℃,respectively

图3套式PCR第1轮最佳退火温度确定

Fig.3 Determination of optimal annealing temperature for first round nested PCR

M.DNA 标准 DL 2 000；.1.阴性对照;2～11.分别为模板量为10、102、103、104、105、 106、107、108、109、 1010拷贝/μL的PCR产物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-11.PCR products of template amounts as10,102,103,104,105,106,107,108,109,1010copies/μL, respectively

图4第1轮套式PCR扩增灵敏性分析

Fig.4 Sensitivity analysis of first round nested PCR amplification

M.DNA 标准 DL 500；1、2.原质粒浓度；3～12.1010、109、108、107、106、 105、104、103、102、10拷贝/μL

M.DNA Marker DL 500；1，2.The original plasmid concentration；3-12.PCR products of template amounts respectively 1010,109,108,107,106,105,104,103,102,10 copies/μL

图5第2轮套式PCR扩增灵敏性分析

Fig.5 Sensitivity analysis of second round nested PCR amplification

M.DNA 标准 DL 2 000；1.阴性对照 ；2～4.模板浓度为106拷贝/μL的质粒

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control;2-4.Template concentration 106copies / μL

图6鸡白痢沙门菌PCR产物重复性分析

Fig.6 Repeatability analysis of PCR products ofSalmonellapullorum

2.3.4 套式PCR方法的特异性分析 以鸡白痢沙门菌为对照，用建立的套式PCR方法对6个非沙门菌病原进行扩增，以鸡白痢沙门菌为模板分别扩增出625 bp(图7A)和278 bp(图7B)的特异性条带，而其他样品均无条带，表明建立的套式PCR方法特异性好。

2.3.5 临床样品的检测结果 对采集已经确认的鸡白痢沙门菌的阳性样品和阴性样品,分别按细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取DNA为模板，用常规的PCR方法检测到阳性样品10份，阴性样品3份，检出率50.00%；用建立的套式PCR方法检测到阳性样品19份，阴性样品5份，检出率95.00%(图8)，这可能是样品中沙门菌含量比较低的原因所造成的。总之，套式PCR的检测率比常规PCR要高很多。

3 讨论

沙门菌是全世界危害最严重的食源性病原菌之一，鸡感染后病死率达83%以上[5]，给畜牧业造成巨大的经济损失。国内外学者一直致力于沙门菌快速检测方法的研究，主要在PCR技术、基因芯片技术、免疫学检测及斑点免疫金渗滤法等方面[6]。沙门菌的血清学种类比较复杂，疫苗种类比较多，养殖户常常是防了又防，但效果甚微，即使发现了该病，也没有一个好的预防药物和方法。沙门菌感染人后可以黏附到小肠黏膜的M细胞，通过M细胞侵入到表皮下层组织，而滤泡上皮细胞中有分布着捕捉抗原的M细胞，具有吞噬功能；而沙门菌含有O、Vi和H等抗原，具有血清抗性，可导致沙门菌释放较强的内毒素，从而使机体产生一些严重不适反应[7-8]。

邵景东等[9]利用免疫胶体金层析法研发出O9群沙门菌胶体金快速检测试剂盒，该方法具有色谱层析法和免疫反应法的共同优势。由于肠炎沙门菌含有一种SEF菌毛，在侵袭过程中具有毒力因子的作用，可以诱导细菌黏附在动物的生殖道和肠道的黏膜细胞上，造成不同的病理反应。蒋颖等[10]利用SEF菌毛建立了肠炎沙门菌特异性的诊断方法，但由于该方法对抗原和试验条件要求比较高，并没有广泛应用到临床检测当中。刘景武等[11]建立的免疫胶体金法检测沙门菌的灵敏度为81.8%，但由于其敏感度问题极容易造成假阴性结果，在实际临床中只能作为一种辅助手段。刘斌等[12]在原有PCR方法的基础上，为了降低检测时出现的假阴性概率，在PCR反应体系中人工加入了1条扩增内标片段，该检测方法的灵敏度可到8 CFU/25 mL,增加了诊断的准确性。Amaro M等[13]基于纳米金材料设计了一种鼠伤寒沙门菌免疫分析法，其检测的下限为42 CFU/mL。李佳桐等[14]根据沙门菌的STN基因的保守序列设计了1套LAMP引物，建立了一种环介导等温扩增鉴定方法，克服了传统方法的局限性，其最低检出细菌浓度为10 CFU/mL,50 min就可以完成检测，但该方法对引物的要求比较高。而本研究根据沙门菌的特异性invA基因，用BLAST检索进行核苷酸序列分析表明，在沙门菌的两个种属中存在较高的同源性，而与其他生物无同源关系；并利用Preimer5.0软件设计两对引物，而内引物位于第1轮PCR扩增产物的内部。

A.第1轮套式PCR特异性分析；M.DNA 标准DL 2 000;B.第2轮套式PCR特异性分析;M.DNA 标准 DL 1 000；1.鸡白痢沙门菌;2～7.多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、李斯特菌、放线杆菌

A.First-round nested PCR specificity analysis；M.DNA Marker DL 2 000；B.Second round nested PCR specificity analysis；M.DNA Marker DL 1 000； 1.Salmonellapullorum；2-7.Pasteurellamultocida,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis,ListeriaandActinobacillus

图7套式PCR特异性分析

Fig.7 Nested PCR specificity analysis

M.DNA 标准 DL 1 000；1～5.阴性样品；6～24.阳性样品 M.DNA Marker DL 1 000；1-5.Negative samples；6-24.Positive samples

综上所述，本研究建立了一种沙门菌的套式PCR检测方法，不需要特殊的仪器和设备，并对反应的引物用量和退火温度进行了优化，试验要求和技术条件一般实验室都能满足，其优势是常规检测方法不能比拟的。但套式PCR也有其不足之处，就是容易造成模板污染和假阳性结果，有待对其进行更深入的研究。对收集的25份临床样品进行检测并与常规PCR方法检测结果进行比较，其灵敏性较高(95.00%)，尤其是对于沙门菌含量极低的样品的检测。同时，对于沙门菌的临床商品化快速检测试剂盒的研究与开发提供了技术参考。

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Abstract:In order to establish a rapid,efficient and simple nested PCR method for detectingSalmonellapullorum,two pairs of specific nested primers were designed according to the highly conserved region of the invA gene ofSalmonellainvasion protein by Primers 5.0 software.The invA gene was cloned from the extractedSalmonellaDNA,and the copy number was calculated as a nested template by ligating the invA gene into the T vector.The optimum nested PCR conditions were determined.The amount of primer used was 0.3 μL respectively,the first annealing of nested PCR was 57.4 ℃ and the second was 53.5 ℃.The method was used to detect the standard plasmids of different concentrations as templates，the sensitivity was 102copies / 20 μL,it was much higher than that of the conventional PCR which was about 106copies / 20 μL.The nested PCR method was used to detect 25 samples collected from a farm in Shihezi,Xinjiang,and the coincidence rate was 95.00% compared with the traditional diagnostic method.The results of the present study showed that the nested PCR method was successful,rapid,feasible,specific and accurate,and it provided a new method for the early diagnosis and study ofSalmonellaspp.

Keywords:Salmonellapullorum; nested PCR; conventional PCR; invA gene; sensitivity

EstablishmentandPreliminaryApplicationofNestedPCRforDetectingSalmonellapullorum

LIU Zhi-ke1,LI Cun-yuan2,ZHANG Qiu-yu3,LIU Yang1,MA Ya-ru1, WANG Yue-li1,CHEN Chuang-fu1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832003,China; 2.CollegeofLifeSciences,ShiheziUniversity,Shihezi，Xinjiang，832003,China; 3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang,Henan,453003,China)

S852.612

A

1007-5038(2017)08-0023-06

2016-11-23

省级协同创新中心项目(2013-179)

刘志科(1989-)，男，河南新乡人，硕士研究生，主要从事人畜共患病研究。△同等贡献作者*