电针风池穴对偏头痛大鼠行为学及三叉神经节5-HT7受体表达的影响

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电针风池穴对偏头痛大鼠行为学及三叉神经节5-HT7受体表达的影响

裴培1，王艳昕1，陈怀珍1，杨文明1，刘璐2，王麟鹏2

目的探讨电针抗偏头痛的可能效应机制。方法54只成年 Sprague Dawley (SD) 雄性大鼠随机分为3组：对照组(仅予颅内电极安置)，模型组(反复电刺激硬脑膜)和电针组(反复电刺激硬脑膜+连续电针风池穴)，每组18只。采用HomeCageScan动物精细行为系统监测大鼠偏头痛样自发性行为，免疫荧光标记和Western blot检测三叉神经节5-HT7受体的表达。结果模型组大鼠探索和运动行为时间显著少于对照组(P<0.001)，而静止、休息和理毛行为时间显著多于对照组(P<0.001)；电针组大鼠探索和运动行为时间显著多于模型组(P<0.001)；而静止、休息及理毛行为时间却显著少于模型组(P<0.001)。模型组大鼠三叉神经节5-HT7受体阳性神经元数目和蛋白相对表达量均显著高于对照组(P<0.0 5)；电针组大鼠以上指标均显著低于模型组(P<0.05)。结论电针可通过下调三叉神经节5-HT7受体表达改善偏头痛大鼠自发性偏头痛样行为。

偏头痛；电针；三叉神经节；5-HT7受体

偏头痛是一种复杂的神经血管性疾病，以反复发作性一侧/双侧搏动样疼痛为典型临床表现，发作时一般伴有活动量减少，活动后疼痛加剧，严重影响了病人生活质量[1- 2]。有关偏头痛的发病机制存在多种假说，其中三叉神经血管学说能较为合理的阐释偏头痛病理生理机制，该学说认为各种原因导致脑膜非特异性神经源性炎症的产生，疼痛信息自外周三叉神经末梢向中枢逐级上传，最终导致三叉神经血管系统的激活，诱发头痛。其中，三叉神经节(trigeminal ganglia，TG)作为该疼痛上行传导通路的Ⅰ级神经元，在外周伤害性信息向中枢传递中具有重要的调节作用。5-HT7受体亚型作为新近被发现的5-HT受体亚型，广泛分布于三叉神经血管系统的各级结构水平，参与对疼痛信息的调控[3]。汇聚解剖、电生理及药理的多项研究，位于TG的5-HT7受体激活后可加剧脑膜神经源性炎症的产生，促进伤害性信息向Ⅱ级神经元(三叉神经脊束核尾侧亚核)及更高级中枢的传递，继而促进三叉神经血管系统的全面激活[4-5]。

针刺防治偏头痛临床疗效显著，但其内在的效应机制仍不明确[6-7]。为探讨针刺治疗偏头痛的神经生物学机制，本研究以反复电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜诱发神经源性偏头痛大鼠模型为研究载体，电针风池穴为干预手段，以TG部位5-HT7受体为研究靶点，应用Homecage动物精细行为智能采集及分析系统监测偏头痛相关自发性行为，Western-blot和免疫荧光半定量检测大鼠TG部位5-HT7受体的表达，探讨电针是否能通过下调5-HT7受体在TG的表达介导抗偏头痛。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠54只，体质量 180 g～200 g(维通利华，合格证号：11400700103582)。饲养条件：室温(23±2)℃，湿度60%，昼夜节律12 h∶12 h(08：00～20：00)饲养条件下单笼喂养，自由摄食水，单笼喂养。适应1周后随机分为3组：对照组、模型组和电针组。3组大鼠皆给予颅内电极安置术，模型组和电针组给予反复硬脑膜电刺激，电针组在电刺激后给予电针“风池”穴治疗。

1.2 主要仪器和试剂 大鼠脑立体定位仪(上海玉研)，电极(北京金冠卓艺)，韩式HANS-200电针仪(南京济生医疗科技有限公司)，YC-2程控电刺激器(成都仪器厂)，Homecage 动物精细行为智能采集及分析系统(美国Clever Systems Inc)，冰冻切片机(CM 3050S，德国Leica)，光学显微镜(DM 5500 B，德国Leica)，电泳仪(165-8004，美国Bio-rad)，转膜仪(170-3935，美国Bio-rad)，高速冷冻离心机(美国Thermo)，Sn-69513型免疫计数器(上海核所日环光电)；5HT7受体抗体 (H 6-NB100-56352，美国Novus)，488-山羊抗兔 (GB 25303，杭州联科)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 (WP 0094，杭州联科)，Potent ECL 发光试剂盒 (WP 0040，杭州联科)，羊抗兔IgG(H+L)HRP 二抗 (111-035-003，美国Jackson)。

1.3 建立偏头痛大鼠模型 ①颅内电极安置术：常规麻醉大鼠(3%戊巴比妥钠，40 mg/kg，腹腔注射)，在脑立体定位仪下行电极安置术。具体实验步骤及注意事项参照Pei等[8]：台式牙科钻分别于大鼠颅中线冠状缝交叉点前4 mm和后6 mm钻孔( 直径约1 mm)，安置自制电极(专利号201420724189.4)，牙托水泥外固定，最后插入电极固定帽以防刺激孔堵塞，术后恢复一周。②反复硬脑膜电刺激：实验1 d、3 d、5 d和6 d予反复硬脑膜电刺激，共4次。电刺激流程参考Pei等[8]：正式刺激前以预刺激(5～10)s，见大鼠出现先给的节律性点头动作，以确定电极连接完好再给予正式电刺激。正式电刺激参数：(1.8～2.0)mA，0.5 ms脉宽，20 Hz，方波，15 min。对照组大鼠仅予接电刺激器但无电流通过。

1.4 电针“风池穴”干预 电刺激结束后立即予以电针治疗。参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的《动物针灸穴位图谱》和《实验针灸学》，取大鼠双侧“风池”，进针深度约3 mm；电针参数：(0.5～1)mA，疏密波，2 Hz /15 Hz，10 min，电流强度以大鼠安静无躁动，耳郭轻度扇动或肌肉局部收缩为度。1 d～6 d连续电刺激6次。

1.5 自发性Homecage行为观察 采用 Homecage 动物精细行为智能采集及分析系统(Clever Systems Inc，Reston，Virginia，USA)，记录并分析大鼠自发性偏头痛样行为。通过侧面视角视频记录和分析笼内大鼠自然行为，利用预先设定的行为定义自动识别分析大鼠精细行为。

对偏头痛大鼠自发性行为的分类[9-10]，分为五大类：探索、运动、静止、休心、理毛行为。记录时间为正式实验前(D0)及正式实验1 d、3 d和5 d电针干预后即刻记录时间为1 h，每次监测前大鼠被放置观察笼预先适应30 min。

1.6 检测指标及方法 实验 7 d时各组大鼠予水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉下取材。 Western blot，取TG组织加入适量裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取40 μL蛋白上样行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，加入一抗(稀释比1∶1 000)4 ℃过夜，加入二抗(稀释比1∶1 000)，ELC曝光显色，扫描底片，并用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析，每组8只。免疫荧光实验，将包埋好的TG组织进行切片，厚度40 μm，依次漂洗、固定、封闭处理，再次漂洗后加入5-HT7受体抗体，抗体浓度1∶100)，4 ℃ 过夜。次日漂洗后加入二抗，避光室温孵育 1 h后封片镜检。荧光倒置显微镜×200 倍视野下随机选取拍摄3～5个非重叠视野，计算平均面积(/100 μm2)下5-HT7阳性神经元数，每组10只。

2 结 果

2.1 行为学 实验前(D0)各组大鼠各行为baseline值无统计学意义；反复硬脑膜电刺激后，模型组大鼠探索及运动行为时间显著少于对照组(P<0.001)，而静止、休息和理毛行为时间显著多于对照组(P<0.001)；反复电针风池穴治疗后，电针组大鼠探索、运动行为时间较模型组显著多于模型组(探索行为，P=0.012；运动行为P<0.001)；而静止、休息及理毛行为时间显著少于模型组(静止/休息行为P<0.001； 理毛行为P=0.004)。详见图1。

图1 电针风池穴对各组大鼠自发性行为的影响

2.2 5-HT7受体在TG的表达 模型组大鼠TG 5-HT7受体阳性神经元数目及蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05)；电针组大鼠5-HT7受体阳性神经元数及蛋白相对表达量均显著低于模型组(P<0.05)。详见图2、图3。

注：与对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

注：A为对照组，B为模型组，C为电针组，D为5-HT7受体阳性神经元计数(/100 μm2)。与对照组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05。

3 讨 论

2004年ICHD-Ⅱ版和2013年ICHD-Ⅲβ版头痛疾病国际分类中有关偏头痛的临床诊断标准提示，偏头痛发作期间病人表现有活动量减少，加大活动量会加刷头痛[1-2]。本研究应用Homecage动物精细行为智能采集及分析系统能监测动物的自发性日常行为，是偏头痛动物模型行为学评价指标[10]。本实验研究发现，反复硬脑膜电刺激能增加大鼠伤害性行为时间，如静止行为、休息行为；减少探索行为和运动行为时间，该结果与Vos等[9]和Melo-Carrillo等[10]既往研究结果一致，亦符合偏头痛病人中常见的活动量减少、劳动力丧失等体征[1，11-12]。本研究中，电针风池穴治疗后，大鼠伤害性行为时间较模型组显著减少，探索行为和运动行为时间较模型组显著增加，提示电针治疗有效。既往研究发现偏头痛大鼠的理毛行为是偏头痛病人痛觉敏化的外在征象[10]。本研究中模型组大鼠理毛时间显著多于对照组，电针干预后又显著减少，行为学水平提示电针可显著改善偏头痛大鼠的痛觉敏化状态。

三叉神经血管学说认为，偏头痛发病时由于三叉神经末梢纤维释放CGRP、SP等扩血管物质，引起颅内外血管扩张、血浆蛋白外渗和肥大细胞脱颗粒等，促使脑膜非特异性炎症的产生，疼痛信息经三叉神经眼支-三叉神经节(Ⅰ级神经元)-三叉神经脊束核尾侧亚核(Ⅱ级神经元)逐级上行传导至高级中枢引发头痛。5-HT7受体与Gs蛋白偶连并刺激cAMP产生，是近些年发现的5-HT受体家族的新成员。多种证据表明5-HT7受体参与偏头痛的发病及疾病进展，是偏头痛防治的新型药物靶点[13-15]。5-HT7受体广泛表达于三叉神经血管系统的各级传导通路，具有易化疼痛的作用，在偏头痛的病理生理中占据重要角色[16]。2001年Terron等尸检中首次发现人类三叉神经节分布有5-HT7受体的mRNA[17]，此后的大量基础研究发现，激活TG上的5-HT7受体能刺激外周三叉神经末梢释放CGRP、SP等血管活性常肽，诱发脑膜非特异性神经源性炎症，继而促进伤害性信息向三叉神经脊束核尾侧亚核及高级中枢的传递，易化疼痛通路的激活和痛觉敏化的形成[3，13，18-19]。

本研究发现，反复硬脑膜电刺激后，大鼠TG 5-HT7受体阳性神经元数及蛋白相对表达量均显著高于对照组，而给予连续电针“风池”穴治疗后，这种高表达又被显著逆转，表现为对照组较低的受体表达，提示电针风池穴抗偏头痛的疗效机制可能部分是通过下调TG 5-HT7受体表达，继而抑制神经源性炎症的产生，抑制三叉神经血管系统的激活。

电针“风池”穴可通过下调TG 5-HT7受体的表达改善偏头痛大鼠自发性偏头痛样行为。

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R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.18.008

1672-1349(2017)18-2247-05

2017-05-29)

(本文编辑 王雅洁)

国家重点基础研究发展计划“973”中医专项(No.2014 CB 543203)，国家自然科学基金资助项目(No.81603680)

1.安徽中医药大学第一附属医院(合肥230031)；2.首都医科大学附属北京中医医院针灸中心

杨文明，E-mail：YangWm8810@126.com

信息：裴培，王艳昕，陈怀珍，等.电针风池穴对偏头痛大鼠行为学及三叉神经节5-HT7受体表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(18)：2247-2251.