D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝联合作用对小鼠认知能力的影响

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D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝联合作用对小鼠认知能力的影响

刘梅讯1，孙天敏2

目的探讨D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝联合作用对小鼠认知能力的影响。方法选取健康小鼠40只随机分为AD模型组、正常组，各20只。对模型组采用三氯化铝、D-半乳糖和亚硝酸钠联合给药，对正常组小鼠相应使用同体积生理盐水给药。均连续给药3个月，观察两组行为学、抗氧化指标和形态学染色的差异。结果①AD模型组的潜伏期、第一次穿越原平台位置的时间均明显长于正常组(P<0.01)，而在原平台象限的活动时间，前者又明显短于后者(P<0.01)；②AD模型组超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性明显降低、低于正常组(P<0.01)，而丙二醛(MDA)含量明显升高，高于正常组(P<0.01)；③刚果红染色，AD模型组海马CA2区细胞外可见多个Aβ斑，而正常组未见Aβ斑；④改良氨银染色，AD模型组海马CA2区可见锥体细胞稀少、不整齐，核周体内棕黑色细丝增粗、局部呈小块状，神经元外可见老年斑；而正常组海马CA2区组织结构清晰。结论通过D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝对小鼠的复合、慢性作用，部分复制了AD的病理变化，是建立AD动物模型比较理想的方法。

阿尔茨海默病；D-半乳糖；亚硝酸钠；三氯化铝；脂质过氧化；学习记忆

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of D-galactose， sodium nitrite，and alchlor on cognitive competence in mice.MethodsThe health mice were selected and divided into Alzheimer’s disease (AD) model group and normal group.Mice in model group were injected with alchlor， D-galactose and sodium nitrite for three consecutive months. Mice in normal group were injected with normal saline of the same volume. The behavior， anti-oxidative index and morphological staining pattern were observed.ResultsThe incubation period and the time when the original platform position passed through for the first time in AD model group were significantly longer than that in normal group (P<0.01).The activity time in the original platform position the former were significantly shorter in AD model group than that in normal group (P<0.01). The activities of SOD， GSH-Px decreased in AD model group，which was lower than that in normal group (P<0.01). MDA concentration rises in AD model group，which was higher than that in normal group (P<0.01). Congo red stainning method showed that many Aβ spots could be seen in hippocampal CA2 sector in AD model group， while no Aβ spot was observed in normal group. Improved amine silver staining method showed that few and irregular pyramidal cells could be found in hippocampal CA2 sector in AD model group. There was thickened black filament around the nucleus and it showed a forma of small patch in some area， and age pigment could be seen outside the neuron. However， the tissue structure of hippocampal CA2 sector of the normal group was clear.ConclusionAD pathological changes are partially modeled by the combined and chronic effect of D-galactose， sodium nitrite and alchlor in mice， which is proved to be an ideal method to establish AD animal model.

Keywords：Alzheimer’s disease；D-galactose;sodium nitrite；alchlor;lipid peroxidation；learning and memory

老年性痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，由德国医生Alois Alzheimer于1906年最先描述，是与年龄高度相关的、以进行性认知障碍为主要表现的中枢神经系统退行性疾病。AD脑三大病理变化为：神经元外由β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)组成的老年斑(senile plaques，SP)、神经元内由异常磷酸化tau蛋白(p-tau)组成的神经元纤维丝缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及神经元及其突触的广泛丢失。但其发病机制尚未完全明了，亦无根治药物。关于AD研究的最大难题是没有特异性的动物模型，以致于严重影响研究的针对性和实用性[1]。因而，探索建立理想的动物模型是目前AD研究最迫切的工作。现有的AD动物模型如老化型、损伤型、转基因型、胰岛素抵抗型、脑缺血型等，均只是在一个局部或一个点反映AD的病理变化和发病机制，急需建立AD复合模型，来揭示AD发病机制、提供研究以及指导治疗[1-3]。为此，本课题探讨D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝联合作用对小鼠认知能力的影响，试图为复制AD动物复合模型提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 健康雄性昆明小鼠40只，SPF级，10月龄，体质量(40±5)g。由湖北医药学院附属太和医院实验动物中心[许可证号：SCXK(鄂)2016-0008、SYXK(鄂)2016-0031]提供。实验前将小鼠适应性喂养两周，且剔除行为学反应明显迟缓者。MT-200水迷宫行为学跟踪系统购于成都泰盟。D-半乳糖(D-galactose；纯度>98%)、亚硝酸钠(Sodium nitrite；纯度>98%)、三氯化铝(Aluminium trichloride；纯度>98%)、谷胱甘肽过氧化酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(武汉博士德)。

1.2 分组与给药 选取健康小鼠40只随机分为两个组：AD模型组、正常组，各20只。对模型组小鼠采用三氯化铝、D-半乳糖和亚硝酸钠联合给药：①D-半乳糖(500 mg/kg；浓度：10 mg/0.1 mL或100 g/L)、亚硝酸钠(45 mg/kg；浓度：0.9 mg/0.1 mL或9 g/L)，配成水溶液、颈背部皮下注射；②三氯化铝(40 mg/kg)，按每只小鼠平均饮水5 mL/ d配制液体，让小鼠自由饮用；均持续用药3个月。对正常组小鼠相应使用同体积生理盐水给药。

1.3 小鼠学习记忆能力的测试 ①定位航行实验。检测小鼠的空间学习记忆过程和能力。连续进行5 d。每只小鼠一天接受3次训练，依次从不同象限中点，头朝池壁入水，去寻找平台，记录小鼠找到平台的潜伏期、搜索策略以及游泳速度。实验时先让小鼠放在平台上适应15 s。若小鼠在60 s内未找到平台，则计潜伏期为60 s。小鼠无论找到平台与否，均被安排在平台上休息15 s，然后才进行下一轮训练。②空间探索实验。观察小鼠的空间记忆保持能力。在定位航行实验结束后第1天进行。移去平台，让小鼠自由游泳30 s、寻找平台。记录每只小鼠第1次穿越原平台位置的时间以及在每个象限的活动时间。

1.4 取材与染色 水迷宫测试完毕后取材即断头取脑：①将小鼠头靠近枕骨剪断，置于事先准备好的冰盘上，并用剪刀剔除头后部的软组织；②由后向前，沿中线剪开小鼠头皮，并将皮肤、皮下组织向两侧分离，暴露颅骨；③同样沿中线向前，剪开枕骨、顶骨直至顶、额两骨分界处，用镊子将颅骨由中线向两侧快速掀开；④轻轻分开脑组织与颅骨，剪断与颅骨相连的脑神经等，取出全脑，在前囟后2.3 mm至前囟后6.3 mm处分离出大脑皮质、海马，用生理盐水清洗，放入液氮中保存。整个操作在2 min之内完成。灌注取脑：用10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠，迅速开胸，剪开右心耳和心尖部，灌注针经左心室插入升主动脉，固定灌注针，用生理盐水(含1% 肝素)快速灌注，直至右心耳流出的液体清亮时更换0.1 mol/L、4℃的固定液快速灌注。快速灌注20 s后，速度调整为20滴/min，持续20 min。灌注完毕后，完整取出脑组织，置4℃冰箱后固定；备用。常规做刚果红染色、改良Bielschowsky氨银液染色[4-5]。

1.5 生化检测 从液氮中取出小鼠大脑皮质、海马，称量、剪碎，按质量体积比(W/V)1∶9加入4℃生理盐水，用电动匀浆机(3 000 r/min)，制成10%大脑皮质、海马组织匀浆液，离心15 min，取上清液分装在EP管中。严格按各试剂盒说明书操作，依次测定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

2 结 果

2.1 两组小鼠学习记忆能力的测试结果 ①在定位航行实验中，从第3天开始，AD模型组的潜伏期明显长于正常组，且它们之间的差距逐渐加大(P<0.05)。在4 d～5 d，AD模型组潜伏期显著长于正常组(P<0.01)。详见图1A。②在空间探索实验中，第一次穿越原平台位置的时间，AD模型组小鼠明显长于正常组 (P<0.01)，而在原平台象限的活动时间，AD模型组小鼠又明显短于正常组(P<0.01)。详见图1B、图1C。

注：1A为潜伏期：与正常组比较，AD模型组# P<0.01 P<0.01，## P<0.01；1B为第一次穿越原平台位置时间：与正常组比较，AD模型组++ P<0.01；1C为在原平台象限活动时间：与正常组比较，AD模型组** P<0.01。图1 两组小鼠学习记忆能力的测试结果

2.2 两组小鼠SOD、GSH-Px及MDA含量检测结果 与正常组对应的3个指标比较，AD模型组SOD、GSH-Px活性明显降低(P<0.01)，而MDA含量明显升高(P<0.01)。详见表1。

表1 两组SOD、GSH-Px及MDA检测结果比较(±s)

2.3 两组脑组织Aβ斑的形成情况 刚果红染色，AD模型组海马CA2区细胞外可见多个Aβ斑，染成淡红色，在其周围可能有浸润的胶质细胞及变性神经细胞染成蓝色，背景清晰(图2A)；而正常组锥体细胞结构清晰，未见Aβ斑(图2B)。

注：2A为AD模型组，2B为正常组

2.4 两组神经元纤维和Aβ斑或老年斑的形态 改良Bielschowsky氨银液染色结果：AD模型组海马CA2区可见锥体细胞排列不整齐、稀疏、萎缩、核固缩，核周体内棕黑色细丝增粗、呈小块状； 轴突内神经元纤维模糊不清；神经元外可见Aβ斑或老年斑，体积较大、数量较多，且周围有浸润的胶质细胞及变性的神经元(图3 A)。正常组海马CA2区锥体细胞的细胞质内，可清晰地看到棕黑色的细丝状结构即神经原纤维，在核周体内交织成网，并伸入树突和轴突；神经元外未见Aβ斑或老年斑(图3B)。详见图3。

注：3A为AD模型组，3B为正常组。

3 讨 论

本实验结果显示，采用D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝对小鼠联合、持续给药3个月后，行为学测试，AD模型组小鼠的潜伏期和第一次穿越原平台位置时间增长，而在原平台象限活动时间缩短。这说明这些小鼠的空间学习记忆能力和空间记忆保持能力出现明显的缺损[6]。AD模型组小鼠大脑皮质和海马组织中SOD、GSH-Px活性明显下降和MDA表达明显上升。这表明小鼠体内产生脂质过氧化(lipid peroxidation，LPO)反应。SOD、GSH-Px是体内十分重要的抗氧化酶，其浓度和活性的降低，会产生大量氧自由基(ROS)损伤脑组织；而MDA是脂质过氧化后的代谢产物，其浓度高低标志着脂质过氧化的程度[7]。AD模型组刚果红染色在神经细胞外可见多个淡红色的类Aβ斑，银染可见海马CA2区锥体细胞丢失、排列紊乱，神经元纤维增粗、局部呈小块状。尽管这些表现不十分典型，但也不同程度地表达AD部分的病理学特征[8]。

本实验将三氯化铝按照每天、每公斤体质量40 mg放入饮用水中，让小鼠自由饮用，且持续时间长达3个月，大大地超过了世界卫生组织1 mg的标准，直接造成小鼠铝的慢性中毒[9]。铝是一种慢性蓄积性神经毒素。三氯化铝毒性一方面通过损害膜结构、介导脂质过氧化[10]；另一方面引起神经元纤维变性、抑制神经传导[11]；还可以诱导α-分泌酶和β-分泌酶活性不均衡作用，导致脑组织β-淀粉样蛋白的过表达[12]。长时间注射D-半乳糖，其代谢产物半乳糖醇不能进一步代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，引起细胞膜脂质过氧化，导致一系列氧化损伤[13]。亚硝酸钠的氧化性能将血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，失去携带、输送氧气功能，使机体组织产生缺氧性中毒[14]。

通过D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝对小鼠的复合、慢性作用，部分复制AD的病理变化。一是脂质过氧化，产生ROS连锁反应，损伤细胞膜，继而神经元变性、坏死；二是可能出现的Aβ斑，诱导神经元过早凋亡；三是可能产生的神经元纤维变性，使神经元纤维退化、萎缩，大脑早老化。这三个发生、发展过程单个或联合作用，均能导致小鼠大脑皮质和海马神经元及其之间的突触丢失，从而导致小鼠认知功能的障碍，即成功复制小鼠AD模型[14]。因此认为，D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝三者联合作用是建立AD动物模型的比较理想的方法[1-3]。

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Effects of D-galactose， Sodium Nitrite and Alchlor on Cognitive Competence in Mice

Liu Meixun， Sun Tianmin

Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， Hubei， China Corresponding Author： Sun Tianmin (Hubei University of Medicine， Shiyan， Hubei， China)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.18.009

1672-1349(2017)18-2251-04

2016-10-19)

(本文编辑 王雅洁)

2014年十堰市科学技术研究与开发立项项目(No.14Y08)

1.湖北医药学院附属太和医院(湖北十堰 442000)；2.湖北医药学院

孙天敏，E-mail：252014327 @qq.com

信息：刘梅讯，孙天敏.半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝联合作用对小鼠认知能力的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(18)：2251-2254.