代谢工程合成5-氨基乙酰丙酸的研究进展

张双虹，邹亚兰，宋 鑫，冯丽丽，陈 涛，王智文

(1．天津大学 化工学院，天津 300350;2．天津大学 系统生物工程教育部重点实验室，天津 300350;3．天津大学 化工协同创新中心，天津 300350;4．山东农业大学 林学院，山东泰安 271018)

代谢工程合成5-氨基乙酰丙酸的研究进展

张双虹1，2，3，邹亚兰1，2，3，宋 鑫4，冯丽丽1，2，3，陈 涛1，2，3，王智文1，2，3

(1．天津大学 化工学院，天津 300350;2．天津大学 系统生物工程教育部重点实验室，天津 300350;3．天津大学 化工协同创新中心，天津 300350;4．山东农业大学 林学院，山东泰安 271018)

5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是生物体内吡咯类物质生物合成的前体物质，在医药和农业领域显示出广阔的市场潜力。随着代谢工程的发展以及对5-ALA生物合成途径的研究，利用微生物合成5-ALA成为研究的新方向。与传统的化学法合成相比，利用微生物合成5-ALA具有低污染、高产率和低成本等优势。本文中，笔者介绍了5-ALA生物合成的最新研究进展，分析了5-ALA代谢途径的关键影响因素，并对未来的研究方向进行了展望。

5-氨基乙酰丙酸;C4途径;C5途径;生物合成

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)是一种非蛋白类氨基酸，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中，是生物体内合成卟啉、叶绿素和维生素B12(VB12)等吡咯类化合物的前体物质。5-ALA在环境中易降解无残留，作为除草剂［1］和杀虫剂［2］可以选择性地杀死双子叶植物的杂草，引起害虫体内生化代谢失衡。此外，5-ALA具有类似于植物激素的生理活性，在植物生长过程中起调节作用，可作为植物生长调节剂［3］使用。在医学领域，作为光动力治疗药物，5-ALA在恶性肿瘤治疗、皮肤癌治疗方面已经显示出广阔的市场前景［4］，在膀胱癌［5］、直肠癌［6］和黑色素瘤［7］治疗方面有良好的效果。现阶段，5-ALA的生产方法包括化学法合成和生物法合成。传统的5-ALA生产主要以乙酰丙酸、糠醛、嘧啶等为原料化学合成，然而化学合成法存在副产物多、产物分离困难和原料价格昂贵等问题，造成5-ALA得率低、生产成本较高［8］，这也是5-ALA市场价格高的原因。随着生物技术的发展，以微生物为底盘细胞，通过代谢工程改造来进行生物法合成成为新的研究方向。本文中，笔者重点介绍5-ALA的生物合成途径，并对近年来微生物合成5-ALA的研究进展进行综述和展望。

图1 5-ALA的生物合成途径Fig.1 Biosynthetic pathways of 5-ALA

1 5-ALA的合成途径

在自然界中，动物、植物和微生物等均可以生产5-ALA，其主要的合成途径有两条［8］：C4途径(C4 pathway)和C5途径(C5 pathway)。C4途径主要存在于动物、真菌、原生动物和一些光合细菌中，如沼泽红假单胞菌。C5途径主要存在于高等植物、藻类和细菌中，如大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌［9］。但是，也有少数微生物同时具有C4途径和C5途径，例如 Euglena gracilis［10］。1.1 C4途径

C4途径如图1所示，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(5-aminolevulinate synthase，ALAS)催化甘氨酸和琥珀酰CoA生成5-ALA，该反应的辅因子是磷酸吡哆醛。ALAS是C4途径中的关键酶，由于光合细菌的ALAS具有较高的酶活，所以研究者主要针对光合细菌的ALAS进行研究，这些光合细菌主要包括类球红细菌［11］和沼泽红假单胞菌等［12］。

目前，利用C4途径代谢工程合成5-ALA的研究主要集中在大肠杆菌。研究者们尝试将不同来源的ALAS在大肠杆菌中表达以提高5-ALA的产量。早在1999年，Bolt等［11］在大肠杆菌中成功克隆了来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的ALAS，测得其比酶活为0．22 U/mg，其对底物琥珀酰CoA和甘氨酸的Km值分别为17 μmol/L与1．9 mmol/L。Choi等［13］在大肠杆菌中克隆了来源于沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)KUGB306 的 ALAS，比酶活为 0．92 U/mg，对琥珀酰CoA与甘氨酸的 Km值分别为 50 μmol/L与 2 mmol/L。Lin等［14］在大肠杆菌表达了来源于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)zju-0121的ALAS，比酶活为0．12 U/mg，对琥珀酰 CoA 与甘氨酸的 Km值分别为257 μmol/L与9．7 mmol/L。2013年，Zhang等［15］克隆了来源于沼泽红假单胞菌的ALAS，ALAS的比酶活为 3．6 U/mg，这是目前报道的最高酶活ALAS，对琥珀酰CoA与甘氨酸的Km值分别为 11 μmol/L 与 3．8 mmol/L。2014 年，Lou等［16］将来源于类球红细菌、放射形土壤杆菌和慢生型大豆根瘤菌的ALAS在大肠杆菌中成功表达，发现这几个ALAS的最适pH均为7．5，最适温度为37℃，在最适条件下，它们的比酶活分别为0．12、0．15和 0．2 U/mg。

1.2 C5途径

在利用C5途径合成5-ALA中，谷氨酸是5-ALA合成的前体物，由于该物质含有五个碳，因此，该合成途径被称为C5途径，具体途径见图1。C5途径需要经过三步反应：谷氨酰tRNA合成酶(GluRS，由gltx基因编码)催化谷氨酸与相应的tRNA相连，生成谷氨酰tRNA;随后，谷氨酰tRNA在谷氨酰tRNA还原酶(GluTR，由hemA基因编码)的作用下还原为谷氨酰-1-半醛(GSA)［17］;最后，谷氨酰-1-半醛在谷氨酰-1-半醛氨基转移酶(GSA-AM，由hemL基因编码)的催化下，生成5-ALA［8］。

C5途径合成5-ALA中，GluTR和GSA-AM(谷氨酰-1-半醛氨基转移酶)是关键酶。GluTR是5-ALA生物合成的第一个关键酶，但是由于该酶蛋白对水解酶敏感，关于该酶蛋白分子结构的报道不多。GluTR受到终产物血红素的调节，当血红素的浓度足够的时候，GluTR的水平会降低，而当限制血红素浓度的时候，GluTR的蛋白量和活力会明显的提高［18］。由 GluTR催化生成的谷氨酰-1-半醛(GSA)是一个不稳定的中间产物，会被迅速催化生成5-ALA，为了减少中间产物GSA的损失，并且加快反应速度，GluTR蛋白和GSA-AM蛋白会形成酶复合体［19］。因此，研究人员认为GSA-AM也是C5途径中参与5-ALA生物合成的一个重要的酶。

表1 微生物生产5-ALA的研究Table 1 Production of 5-ALA by microorganism

2 代谢工程改造微生物合成5-ALA

表1列举了不同微生物菌株合成5-ALA的情况。产生5-ALA的微生物包括光合细菌、大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌等。近几年，通过代谢工程改造微生物合成5-ALA成为了研究的热点，其工程策略主要包括：不同来源ALAS酶基因的异源表达优化，提高前体物甘氨酸和琥珀酰CoA的供给，限速酶GluTR的稳定性改进，降低副产物的溢流代谢和强化5-ALA的胞外运输等。

2.1 大肠杆菌代谢工程改造合成5-ALA

2．1．1 C4途径代谢工程改造合成5-ALA

通过代谢工程方法合成5-ALA的研究主要集中在大肠杆菌中进行，提高ALAS的酶活是改造的关键。早在1996年，Vander Werf等［25］将来源于类球红细菌(R．sphaeroides)的hemA基因克隆至大肠杆菌中，实现了hemA基因的活性表达，通过对发酵培养基以及发酵条件等进行优化，使得5-ALA的最终产量达到了2．88 g/L。为了提高ALAS的酶活，Fu等［27］分析了 ALAS 在 E．coli BL21(DE3)和E．coli Rosetta(DE3)(稀有密码子优化菌株)中的表达差异，发现：来源于类球红细菌(R．sphaeroides)的hemA基因在密码子优化的菌株 E．coli Rosetta(DE3)中可以更好地表达，使5-ALA的产量提高至3．80 g/L。Jeong等［39］发现5-ALA 的生物合成可能与细胞内的氧化还原电势有着密切的关系，当同时过表达依赖于NADPH的苹果酸酶基因maeB和5-氨基乙酰丙酸合酶编码基因hemA，能够明显提高ALAS的活力。琥珀酰CoA是5-ALA合成的前体物，为了解决前体物供应的问题，Kang等［40］将5-氨基乙酰丙酸合酶编码基因导入到一株琥珀酸生产菌株中，5-ALA的产量较之前提高了4倍。Yang［33］等发现发酵过程中的溶氧水平对ALAS的活力有影响，菌体对数生长期中一定时间的厌氧控制对ALA产量的提高有促进作用，最终在15 L发酵罐中5-ALA 产量达 9．4 g/L。Ding［9］等在大肠杆菌中过表达优化来自光合细菌(Rhodobacter capsulatus)的hemA基因，将5-ALA的产量从20 mg/L提高到689 mg/L，进一步过表达辅酶A合成路径相关基因，下调hemB基因的表达，最终ALA产量达2．81 g/L。

2．1．2 C5途径代谢工程改造合成5-ALA

鉴于大肠杆菌自身能够利用C5途径进行5-ALA的合成，近几年来，人们也开展了利用C5途径进行5-ALA代谢工程合成的研究。Kang等［28］首先在大肠杆菌中分析了C5途径中涉及的3个酶GluRS、GluTR和GSA-AM对5-ALA合成的影响，结果发现，GluTR是5-ALA生物合成过程中的限速酶。由于该酶的稳定性很差，将来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Arizona)的hemA基因的N端编码Thr-2和Leu-3氨基酸的密码子之间插入了两个编码赖氨酸的密码子：AAGAAG。进一步在大肠杆菌中过表达突变型hemAM基因，5-ALA的产量提高到0．18 g/L。此外，他们还发现GSA-AM和HemAM酶具有协同作用，在此基础上过表达rhtA基因，5-ALA的产量提高到 4．13 g/L。2015 年，Zhang等［26］研究发现hemB、hemD、hemG和hemH是5-ALA下游代谢合成血红素的关键基因，上调hemD和hemF基因的表达有利于5-ALA的积累，而过表达hemB、hemG和hemH基因并不利于5-ALA的积累。最终通过在大肠肝菌中组合过表达hemA、hemL、hemD和hemF基因，5-ALA 产量达到 3．25 g/L。Zhang 等［41］通过酶工程手段对GluTR进行改造，在GluTR的N末端插入赖氨酸或精氨酸残基以提高GluTR的稳定性，5-ALA的产量较之前提高了1．76倍。研究人员还发现了离子平衡对于5-ALA的积累有影响，Li等［42］基于RyhB调节离子平衡的作用，通过表达ryhB基因，使5-ALA的产量提高16%，该研究对于利用非编码RNA(Small RNA)调节5-ALA积累有指导意义。Zhang等［43］同样发现了离子浓度对于5-ALA积累的影响，在优化离子添加浓度基础上，过表达hemA、hemL、hemD和 hemF基因，分批发酵产量达4．05 g/L。

2.2 谷氨酸棒状杆菌代谢工程改造合成5-ALA

谷氨酸棒状杆菌是从土壤中分离得到的革兰氏阳性菌，在工业上广泛应用于生产氨基酸、胺类以及生物能源等，是一株食品安全菌株。5-ALA的C5合成途径前体是谷氨酸，谷氨酸棒状杆菌能天然分泌谷氨酸，无需外源添加其他前体物质，从而降低了生产成本。而且谷氨酸棒状杆菌本身没有甘氨酸裂解系统，可以有效避免甘氨酸在胞内的降解［36］。因此谷氨酸棒状杆菌被认为是合成5-ALA的重要潜力菌株。

2．2．1 C4途径代谢工程改造合成5-ALA

笔者所在的课题组在利用谷氨酸棒状杆菌通过C4途径代谢工程改造合成5-ALA方面进行了系列研究。2015年，Feng等［36］在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入类球红细菌(R．sphaeroides)的hemA基因，敲除生成乙酸、乳酸的合成途径基因，敲除编码青霉素结合蛋白的pbp1b基因，过表达源自大肠杆菌的rhtA基因，5-ALA在5 L发酵罐中流加发酵时，产量达到了7．53 g/L。在此基础上，Zou等［38］研究了丝氨酸及甘氨酸合成途径对5-ALA合成的影响，结果表明，甘氨酸合成途径是5-ALA合成的关键途径。2016年，Yang等［37］比较了不同来源的 ALAS对5-ALA合成的影响，将来自Rhodobacter capsulatus SB1003的ALAS进行密码子优化，两阶段发酵5-ALA产量达12．4 g/L，进一步过表达来自大肠杆菌的RhtA运输蛋白，使得5-ALA产量达到14．7 g/L，为目前谷氨酸棒杆菌代谢工程合成5-ALA的最高产量。

2．2．2 C5途径代谢工程改造合成5-ALA

通过C4途径的代谢工程改造合成5-ALA，甘氨酸的供给是重要的限制因素，发酵过程中往往需要添加甘氨酸，从而造成成本提高。此外，一定浓度的甘氨酸对菌体的生长有抑制作用，也影响了发酵过程。而谷氨酸棒状杆菌C5途径合成5-ALA的过程中，谷氨酸棒状杆菌的天然产物谷氨酸是5-ALA的前体物，显示了可以直接利用葡萄糖进行代谢合成5-ALA的天然优势。

最近，Yu等［34］鉴定了谷氨酸棒杆菌中利用C5途径合成5-ALA的关键基因hemA和hemL，而且他们发现溶氧水平和Fe2+对5-ALA的发酵具有重要的影响，通过在谷氨酸棒杆菌中表达不同来源的hemA和hemL基因，5-ALA的最终产量达到了 1．79 g/L。2015年，Ramzi等［35］将 来 自 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌(Salmonella typhimurium)的hemA基因定点突变后在谷氨酸棒状杆菌中表达，同时表达hemL基因，经过发酵优化，5-ALA的最终产量达到了2．2 g/L。

3 展望

近年来，5-ALA的微生物合成已经取得了较大进步，显示了微生物法工业化生产5-ALA的良好前景。在C4途径中，ALAS的酶活是关键因素，前期研究多集中在不同宿主的hemA基因在模式菌株大肠杆菌中异源表达与选择。随着酶工程的发展，通过半理性/理性方法构建稳定的调控解除的ALAS酶，是代谢工程改造合成5-ALA的重要研究方面。到目前为止，通过C5途径可以实现以葡萄糖为底物的5-ALA合成，然而C5途径及其5-ALA下游代谢合成血红素途径，多为必需基因及其相关途径，基因调控复杂，这对进一步理性代谢工程改造造成了阻碍，需要进一步加强相关途径的酶及其基因表达调控的研究，为理性代谢工程改造合成5-ALA提供理论基础。

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(责任编辑 荀志金)

Advances in 5-aminolevulinic acid microbial production

ZHANG Shuanghong1，2，3，ZOU Yalan1，2，3，SONG Xin4，FENG Lili1，2，3，CHEN Tao1，2，3，WANG Zhiwen1，2，3
(1．School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China;2．Key Laboratory of Systems Bioengineering of the Ministry of Education，Tianjin University，Tianjin 300350，China;3．Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300350，China;4．College of Forestry，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China)

5-Aminolevulinic acid(5-ALA)is a common precursor of the tetrapyrrole biosynthesis pathway in organisms and has broad application potentials in medicine and agriculture．With the rapid development of metabolic engineering and biosynthetic pathway of 5-ALA microbial production，scientists have tried to produce 5-ALA by biosynthesis．Compared to its chemical synthesis，microbial production of 5-ALA has many advantages，including low pollution and high productivity．This review summarizes the recent progress in microbial production of 5-aminolevulinic acid，and analyzed the key factors in 5-ALA production，and discusses future directions of 5-ALA research．

5-aminolevulinic acid;C4 pathway;C5 pathway;biosynthesis

Q812

A

1672-3678(2017)05-0065-06

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．008

2017-07-06

天津市自然科学基金(15JCQNJC06000);国家自然科学基金(21576200、21621004、21390201)

张双虹(1993—)，女，河北邢台人，研究方向：发酵工程;王智文(联系人)，副教授，E-mail：zww@tju．edu．cn