大肠杆菌芳香族氨基酸代谢工程研究进展

鄢芳清，韩亚昆，李 娟，李燕军，2，3，徐庆阳，2，3，陈 宁，2，3，谢希贤，2，3

(1．天津科技大学生物工程学院，天津 300457;2．代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457;3．天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津 300457)

大肠杆菌芳香族氨基酸代谢工程研究进展

鄢芳清1，韩亚昆1，李 娟1，李燕军1，2，3，徐庆阳1，2，3，陈 宁1，2，3，谢希贤1，2，3

(1．天津科技大学生物工程学院，天津 300457;2．代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457;3．天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津 300457)

芳香族氨基酸包括L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp)，是生物体内非常重要的必需氨基酸，具有重要的生物学功能，广泛应用于医药、食品和饲料等领域。本文中，笔者介绍了芳香族氨基酸的生物合成途径以及代谢调控，综述了构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株的代谢工程策略。针对现阶段工业化生产芳香族氨基酸存在的问题，笔者对进一步应用代谢工程策略改造芳香族氨基酸菌株进行了展望。

芳香族氨基酸;大肠杆菌;代谢工程

芳香族氨基酸包括L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp)，是生物体内非常重要的必需氨基酸，具有重要的生物学功能，广泛应用于医药、食品和饲料等领域［1］。L-酪氨酸常作为营养补充剂以及L-多巴和对羟基肉桂酸等医药化工产品的制备原料，被广泛应用在食品、饲料、医药和化工等行业［2］。L-色氨酸被称为第二必需氨基酸，近些年饲料添加剂方面的用量增长快速，已成为第四大饲料氨基酸［3］。L-苯丙氨酸及其衍生物具有抗高血压作用，也是合成抗癌药物中间体的良好载体，L-苯丙氨酸与L-天冬氨酸缩合生成甜味剂天冬甜二肽，适合于减肥和糖尿病人使用［4］。近年来，色氨酸和苯丙氨酸的市场需求量逐年增加［5］，巨大的市场对芳香族氨基酸的工业化生产提出了更高要求。

芳香族氨基酸的生产方法有提取法、化学合成法、酶法及微生物发酵法。提取法和化学合成法最早应用于生产芳香族氨基酸，但存在原材料有限、工艺复杂、所得产品纯度较低等问题，因而已逐渐被淘汰;而利用芳香族氨基酸合成酶系的酶法虽然可以得到纯度较高的产品，但其所需要的前体物吲哚、邻氨基苯甲酸和L-丝氨酸等价格较高，很难进行大规模控制生产;微生物发酵法是以葡萄糖或糖蜜等廉价原料通过发酵生产芳香族氨基酸，由于其生产成本相对较低，生产工艺相对简单可控，已经成为芳香族氨基酸最具有前景的生产方法［1］。芳香族氨基酸生物合成代谢途径长而复杂，无论从自然界中筛选获得具有产酸能力的菌株，或是采用经典的物理化学诱变，获得具备工业化生产潜力的高效芳香族氨基酸菌株难度很大。随着现代生物技术的发展，应用代谢工程策略构建高产的基因工程菌株是近年来芳香族氨基酸生产菌株选育的新热点［6-7］。利用代谢工程策略构建芳香族氨基酸生产菌株已经取得许多突破性的进展(表1)，但与谷氨酸和赖氨酸等大宗氨基酸相比，发酵法生产芳香族氨基酸的糖酸转化率偏低，并且工业化生产控制难度大，因此，继续通过芳香族氨基酸合成途径合理设计和代谢改造显得尤为重要。

表1 代谢工程构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株Table 1 Construction of AAAs producing strains by metabolic engineering

1 芳香族氨基酸生物合成途径及其调控

大肠杆菌遗传背景清楚、载体受体系统完备、生长迅速、基因操作相对简单，适合利用代谢工程方法构建芳香族氨基酸高产菌株［6-7］。大肠杆菌中芳香族氨基酸生物合成途径分为中心代谢途径、共同途径和分支途径。图1为大肠杆菌中芳香族氨基酸的生物合成途径及其调控机制。其中，芳香族氨基酸的中心代谢途径指葡萄糖经磷酸转移酶系统(PTS)转运后分别进入糖酵解途径和磷酸戊糖途径产生磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P);共同途径又称莽草酸途径，指PEP和E4P缩 合 生 成 3-脱 氧-σ-阿 拉 伯 庚 酮 糖 酸-7-磷 酸(DAHP)后经六步反应生成分支酸;分支途径指分支酸作为3种芳香族氨基酸共同前体物经不同酶催化形成相对应的芳香族氨基酸［16］。

图1 大肠杆菌中的芳香族氨基酸生物合成途径及其代谢调节机制Fig.1 Biosynthetic pathway and metabolic regulation mechanism of aromatic amino acids in E．coli

如图1所示，大肠杆菌的芳香族氨基酸合成途径中许多关键限速酶的酶活或表达强度受到代谢终产物的强烈反馈抑制或阻遏，如L-色氨酸合成途径中的邻氨基苯甲酸合成酶(TrpE)，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸合成途径中的双功能酶分支酸异构酶和预苯酸脱水酶(PheA，TyrA)。在大肠杆菌芳香族氨基酸的合成途径中，其关键酶受到的转录阻遏调控是由TrpR蛋白和TyrR蛋白实现的，在L-苯丙氨酸或L-酪氨酸难度较高的情况下，TyrR蛋白与其结合形成有活性的阻遏蛋白，阻止关键酶基因aroG以及代谢通路中其他基因的表达。而在L-色氨酸浓度较高的情况下，TrpR蛋白与L-色氨酸结合后，形成有活性的阻遏蛋白，阻止色氨酸操纵子及关键酶基因aroH的转录。另外，在野生型大肠杆菌中的色氨酸操纵子与pheA基因的上游均存在编码前导肽的序列，该序列能编码弱化子的形成，一旦有L-色氨酸或L-苯丙氨酸过量积累，弱化子将会形成茎环结构，相关基因的转录将会停止［6-7，16］。由于大肠杆菌中上述复杂的反馈抑制和阻遏机制的存在，大肠杆菌积累芳香族氨基酸的能力受到严重制约。因此，解除芳香族氨基酸合成途径中相关关键酶的反馈抑制并解除其转录负调控，是利用代谢工程策略构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株的重要环节。

2 构建芳香族氨基酸生产菌株的代谢工程策略

代谢工程主要是指通过对细胞内代谢相关的酶、物质运输和调节机制等的改造，从而达到提高目标产物产量的目的。在代谢控制发酵的理论指导基础上，大部分氨基酸和核苷酸等生产菌株的代谢工程策略可总结为“进”“通”“节”“堵”“出”的五字策略。相类似地，大肠杆菌芳香族氨基酸的代谢工程改造也可以由该五字策略来总结。

2.1 “进”“出”——糖转运系统与芳香族氨基酸转运系统的改造

大肠杆菌在利用外界葡萄糖时，主要利用磷酸转移酶转运系统(PTS)转运和磷酸化葡萄糖进入细胞内进行代谢，每转运1分子葡萄糖都要消耗1分子PEP转化为PYR(图1)。在以葡萄糖为唯一碳源的培养体系中，PTS系统消耗近50%的PEP来转运葡萄糖［17］。PEP是参与芳香族氨基酸合成途径的直接前体物，也可以直接参与ATP的合成，与TCA循环中物质能量代谢有直接的联系，所以对于构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株，PTS系统的代谢工程改造显得尤为重要。由于涉及能量代谢，完全失活PTS系统可能会造成大肠杆菌本身生长和葡萄糖利用受到限制，大部分涉及PTS系统的改造均选择通过其他糖转运系统替换PTS系统。近年来，涉及PTS系统改造的代谢工程策略主要应用于芳香族氨基酸途径中的中间代谢产物莽草酸生产菌株的改造，并且大部分研究者依旧停留在构建质粒过表达相关基因的水平上，很少见染色体水平上的改造报道［18］。

对大肠杆菌而言，除了可以利用PTS系统转运葡萄糖外，还可以利用半乳糖透过酶(GalP)介导的葡萄糖激酶转运系统来转运葡萄糖，但是该转运系统只有在胞外葡萄糖浓度很低时才会被乳糖诱导［17-20］。在构建大肠杆菌莽草酸生产菌时，研究者在失活PTS系统的同时，通过增强两条不消耗PEP的糖转运系统，以达到减少前体物PEP消耗的目的。其一是过表达大肠杆菌自身的galP基因和glk基因，以强化GalP介导的葡萄糖转运系统，提高葡萄糖的利用率［19-20］;其二是采用Zymomonas mobilis的葡萄糖透过酶(Glf)和葡萄糖激酶(Glk)介导的葡萄糖转运系统替换PTS系统［21-22］。通过在大肠杆菌的PTS缺陷型菌株中表达含Zymomonas mobilis的glf基因和glk基因的质粒，可以弥补由于PTS缺陷造成的葡萄糖利用速度下降带来的不利影响。Chandran等［23］在构建大肠杆菌芳香族氨基酸中间代谢产物莽草酸生产菌株时，在PTS缺陷的大肠杆菌中过表达关键酶的同时过表达glf和glk基因，可在10 L发酵罐中积累莽草酸达84 g/L，产率为33%。对于大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株构建而言，失活PTS系统，同时强化非PTS的葡萄糖转运系统，同样有助于提高产率与糖酸转化率。由于非PTS的糖转运系统转运葡萄糖的能力不足以弥补PTS系统的缺失，因此生产菌株的生长和糖代谢会减慢，有可能会导致发酵的强度降低。

在大肠杆菌中，芳香族氨基酸转运系统主要有3种转运蛋白参与：Mtr、TnaB和 AroP，其中，Mtr和TnaB特异性吸收L-色氨酸，Mtr作为高特异性L-色氨酸转运蛋白，也参与中间代谢产物吲哚的吸收转运，AroP是可以吸收3种芳香族氨基酸的转运蛋白［5］。Zhao 等［24］和 Gu 等［25］敲除了 L-色氨酸生产菌的单个或多个编码吸收转运蛋白的基因，一定程度上均提高了L-色氨酸的积累。对于芳香族氨基酸向大肠杆菌细胞外的转运，研究显示，过表达yddG基因可以提高大肠杆菌对芳香族氨基酸的转运。Liu等［26］在大肠杆菌L-色氨酸生产菌株中过表达yddG基因后，对L-色氨酸的积累有明显的促进作用。Liu等［13］在构建大肠杆菌L-苯丙氨酸生产菌株时也过表达了yddG基因以促进L-苯丙氨酸向胞外的转运。

2.2 “通”——解除反馈抑制与过表达关键酶使芳香族氨基酸合成途径通畅

在大肠杆菌芳香族氨基酸合成途径中，对其合成影响较大的主要是DHAP合成酶和相关芳香族氨基酸分支途径的合成酶(图1)。DHAP合成酶由3个基因编码，分别是aroG、aroF和aroH，在整个酶活中所占的比例分别为80%、20%和1%，它们分别受到L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和 L-色氨酸的反馈抑制［6-7，16］。另外，在芳香族氨基酸分支途径中的各个合成酶均会受到相对应产物的严格反馈抑制和相关阻遏蛋白的反馈阻遏。L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸分支途径中所对应的关键酶分别为邻氨基苯甲酸合成酶(TrpE)及双功能酶分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(PheA，TyrA)［16］。为了使芳香族氨基酸合成途径通畅，积累更多的芳香族氨基酸，解除产物对关键酶的反馈抑制至关重要。很多研究者通过诱变育种随机筛选突变株或分析关键酶的蛋白三维结构得到了许多含突变位点的关键酶，均能不同程度地解除产物的反馈抑制(表2)。另外，在芳香族氨基酸的合成途径中，由TrpR和TyrR 2种阻遏蛋白介导的反馈阻遏作用在大肠杆菌中非常严谨。因此，在利用代谢工程策略构建相关芳香族氨基酸生产菌株时，trpR和tyrR 2个基因的敲除以解除其反馈阻遏调节也是必要的［16］。

表2 大肠杆菌芳香族氨基酸合成途径中解除反馈抑制的关键酶Table 2 Feedback-resistant key enzymes of AAAs biosynthetic pathway in E．coli

在大肠杆菌正常的生长代谢过程中，其碳代谢流进入莽草酸途径所占比例通常不超过2%［6-7］，因此，即使解除关键酶的反馈抑制和反馈阻遏调节，也很难达到高产芳香族氨基酸的目的。为解决合成代谢流少的问题，在大肠杆菌原有相关基因的基础上，过表达关键限速酶基因显得尤为重要。在构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株时，大部分研究者都通过过表达相关关键限速酶基因取得了良好的效果，3种芳香族氨基酸都在大肠杆菌中实现了有效地积累(表1)。但是，这些研究大多采用构建重组质粒的方式增加关键酶的表达强度，这样的策略虽然可以增加芳香族氨基酸的积累，但也存在菌体负担重、菌株具有抗生素抗性、质粒易丢失和糖酸转化率偏低等问题，使利用大肠杆菌工业化生产芳香族氨基酸难度大大增加。目前，只有L-苯丙氨酸在生产上达到相对较高的产量和转化率(25%左右)，L-色氨酸在工业化生产中的糖酸转化率很难达到20%，而L-酪氨酸工业上还是主要依靠化学合成法进行生产。因此，在基因组层面对大肠杆菌芳香族氨基酸合成途径进行相对应的改造，以解决进入芳香族氨基酸合成代谢流少和糖酸转化率低等一系列问题，将是下一步利用代谢工程策略构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株的重点。

为了使大肠杆菌中的芳香族氨基酸合成途径更加通畅，除了过表达关键限速酶以外，保证芳香族氨基酸合成途径中所涉及前体物的充足供应也非常重要。除了PEP外，芳香族氨基酸合成途径中还涉及其他前体物的供应(图1)，其中以L-色氨酸合成途径中所涉及的前体物最为广泛和复杂［36］。与关键酶过表达相似，为保证相关前体物的充足供应，研究者通常采用过表达合成基因的方式增加各种前体物的合成，相关前体物及合成基因总结见表3。

在大肠杆菌芳香族氨基酸合成途径中，除PEP和E4P直接进入莽草酸途径作为其碳骨架前体物外，还需要许多前体物的参与才能合成芳香族氨基酸，而各前体物参与的方式以及供应量都有所不同。因此，在强化相关基因表达量时，保证各前体物的协调平衡供应对芳香族氨基酸代谢合成非常重要。如在L-色氨酸合成途径中(图1)，涉及的前体物包括L-谷氨酰胺、L-丝氨酸和PRPP。另外，在大肠杆菌芳香族氨基酸合成途径中，有多步反应需要NADPH提供还原力参与相关酶的催化反应［36］。2016年，Chen等［11］在构建大肠杆菌L-色氨酸生产菌株时，在增强L-色氨酸操纵子表达的基础上，将强启动子Ptac控制的aroGfbserAfb人工操纵子整合至大肠杆菌基因组后，可积累40 g/L左右的L-色氨酸。对该菌株胞内外的各成分测定发现，强化serA表达的工程菌的胞内L-丝氨酸可以满足L-色氨酸合成的需要。L-色氨酸合成的另一个前体物L-谷氨酰胺的胞内含量较低，相反，L-谷氨酸含量相对较高，因此推测L-谷氨酰胺供应不足可能是影响L-色氨酸生产的又一限制因素。另外，增强NADPH和PRPP等其他前体物的供应在构建芳香族氨基酸生产菌中的报道较少。从现有的研究分析，适当提高芳香族氨基酸前体物的合成，达到前体物的协调供应且不造成碳代谢流的流失，是进一步提高大肠杆菌芳香族氨基酸产率与转化率的关键。

表3 代谢工程增加大肠杆菌芳香族氨基酸合成前体物Table 3 Increase of precursor supply of AAAs in E．coli by metabolic engineering

2.3 “节”“堵”——降低副产物的形成与阻止产物的降解

为使大肠杆菌将更多的碳源转化为芳香族氨基酸，需要节省其竞争途径以降低副产物的形成。如图1所示，芳香族氨基酸合成途径的竞争途径主要指PEP进入莽草酸途径与PEP转化为PYR之间的竞争以及各芳香族氨基酸分支途径之间的竞争。在大肠杆菌中，PEP的主要代谢途径是转化为PYR后进入TCA循环，为尽可能降低该代谢支路的损失，Weiner等［12］在构建大肠杆菌 L-苯丙氨酸生产菌时通过敲除编码丙酮酸激酶基因pykA和pykF以达到提高其产量和转化率的目的。在另外2种芳香族氨基酸生产菌株的构建研究中，很少有通过同时敲除pykA和pykF两基因的研究报道，这可能是因为同时失活pykA和pykF后，丙酮酸合成不足以供应菌体自身能量代谢，对菌体生长有较大影响。

对于大肠杆菌芳香族氨基酸分支途径之间的竞争，有研究报道称在过表达抗反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(trpEfb)后，由于其对分支酸的亲和性远远高于另外2种双功能酶分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(pheA，tyrA)。所以在构建L-色氨酸生产菌时，只要有足够强度的邻氨基苯甲酸合酶表达，用于合成L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸的代谢流损失就会很少［6-7］。Zhao 等［8］在构建 L-色氨酸生产菌时，通过敲除pheA和tyrA基因显著地提高了L-色氨酸的积累量，这可能原因是其邻氨基苯甲酸的表达强度不够导致。另外，同时敲除这2个基因后，需在培养基中添加L-苯丙氨酸和L-酪氨酸，该工程菌才可以正常生长发酵。因此，对于芳香族氨基酸分支途径相互之间的竞争，在外界添加相应芳香族氨基酸不影响菌体生长的条件下，可以通过敲除相关的分支途径合成基因减少代谢流的损失，以便更多地积累目标芳香族氨基酸［40］。

大肠杆菌中L-色氨酸在色氨酸酶(TnaA)的作用下分解为吲哚和L-丝氨酸，tnaA基因(tna操纵子的一部分，其余部分包括tnaB和tnaC分别编码色氨酸转运蛋白和前导区域)的敲除可以阻断L-色氨酸的降解，同时减少L-色氨酸向胞内的转运，从而提高L-色氨酸的积累［41］。对于另外2种芳香族氨基酸降解机制未见研究报道，其工程菌的构建也未见涉及阻断产物降解的策略。

2.4 其他相关芳香族氨基酸生产菌株代谢工程策略

由于芳香族氨基酸生物合成代谢途径长而复杂，副产物具有许多不确定性，且涉及的前体物和相关辅助因子较多，在利用传统的代谢工程五字策略改造大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株时很难顾及所有因素。除了以上介绍的常规代谢工程策略，许多有效的代谢工程新策略也被越来越多地应用于芳香族氨基酸菌株的构建。例如，增强PEP合成的另一种策略是缺失全局碳调控因子csrA［42］。贮碳因子(carbon storage regulator)是一种从整体代谢水平上参与调控RNA的结合蛋白，对负责分解PEP的丙酮酸激酶(Pyk)正调控，对负责PEP生成的PEP羧激酶(PckA)以及PEP合成酶(PpsA)负调控。因此csrA的敲除可以解除这些调控，从而有利于PEP的积累。另外，Liu等［43］在L-色氨酸生产菌中通过敲除缺失全局碳调控因子fruR也达到了相似的效果，从而有效地提高了L-色氨酸的产量与转化率。

作为大肠杆菌生长和代谢过程主要副产物，乙酸的积累不仅消耗碳代谢流，且过量的积累还会对细胞产生毒害作用从而抑制生长［44］。目前，在大肠杆菌的芳香族氨基酸发酵中，乙酸也是主要的副产物，其积累主要是因为溢流代谢，超过2 g/L的乙酸积累就会显著影响细胞生长和产物合成。目前在芳香族氨基酸的工业化生产中，主要通过控制葡萄糖的摄取速率减少乙酸积累，但这种方法也加大了其工业化生产的难度，提高了生产成本。在大肠杆菌中主要有两条乙酸的合成途径，一条是通过PoxB氧化酶途径，由丙酮酸氧化酶(PoxB)催化乙酸形成;另一条是pta-ackA途径，通过磷酸乙酰转移酶(Pta)和乙酸激酶(AckA)催化连续的两个反应，由乙酰-CoA生成乙酸，这也是乙酸形成的主要途径［44］。在 Liu等［45］的研究中显示，直接敲除 pta基因对菌体生长影响很大，造成L-色氨酸产量大幅度降低，这可能是由于pta基因在大肠杆菌中有较多生理功能，pta基因敲除后影响了菌体的生长，从而对L-色氨酸的积累产生负面作用。该研究将pta基因进行了定点突变(Pro69Leu)，降低了磷酸乙酰转移酶的活性，有效地减少了乙酸积累。在 Zhao等［46］的 L-色氨酸生产菌的研究中，敲除 ackA和tdcD基因使得乙酸的积累减少了21．79%，同时，L-色氨酸的产量提高了6．49%。综上所述，乙酸作为大肠杆菌芳香族氨基酸生长发酵过程具有毒害作用的主要副产物，虽然通过一些代谢策略能降低其积累量，但仍无法满足工业化生产所需要的条件，因此需要进一步优化菌株代谢途径，减少因溢流代谢导致的乙酸积累。除此之外，芳香族氨基酸合成的高ATP需求，发酵过程的高溶氧需求，胞内外产物的实时检测，中间代谢物积累的实时检测等一系列问题，都对大肠杆菌芳香族氨基酸代谢工程研究改造提出了更高的要求。

3 总结与展望

随着现代生物技术的发展，应用代谢工程策略重新合理设计并改造大肠杆菌的生物代谢途径，在构建芳香族氨基酸生产菌株方面取得了显著的进步。但由于大肠杆菌中芳香族氨基酸代谢途径长而复杂，涉及的前体物很多，代谢工程改造难度很大。尤其对于L-色氨酸而言，作为大宗饲料用的氨基酸，现有工业化菌株的产率和糖酸转化率很难满足其市场需要。另外，L-酪氨酸目前还没有成熟的工业化发酵法生产技术进行工业化生产，而L-苯丙氨酸也普遍存在乙酸积累和糖酸转化率低等问题。因此，在已有代谢工程策略构建芳香族氨基酸生产菌的基础上，需要应用新兴的代谢网络模拟计算、代谢网络定量分析和一些基因组编辑和干扰等技术对芳香族氨基酸合成途径进行更系统地组合优化，从而构建更加高效的大肠杆菌芳香族氨基酸工程菌，有效地提高发酵产率和糖酸转化率，这也是将来芳香族氨基酸代谢工程的主要发展方向。

［1］ 申晓林，袁其朋．生物合成芳香族氨基酸及其衍生物的研究进展［J］．生物技术通报，2017，33(1)：24-34．

［2］ 姚元锋，赵广荣．L-酪氨酸代谢工程研究进展［J］．食品与发酵工业，2013，39(5)：132-137．

［3］ 赵春光，程立坤，徐庆阳，等．微生物法生产 L-色氨酸的研究进展［J］．发酵科技通讯，2008，37(4)：34-36．

［4］ 李冀新，张超．L-苯丙氨酸生产及应用研究进展［J］．氨基酸和生物资源，2006，28(2)：51-56．

［5］ LI Z，JI X，KAN S，et al．Past，present，and future industrial biotechnology in China［J］．Adv Biochem Eng Biotechnol，2010，122：1-42．

［6］ RODRIGUEZ A，MARTNEZ J A，FLORES N，et al．Engineering Escherichia coli to overproduce aromatic amino acids and derived compounds［J］．Microb Cell Fact，2014，13(1)：126-130．

［7］ BONGAERTS J，KRÄMER M，MÜLLER U，et al．Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds［J］．Metab Eng，2001，3(4)：289-300．

［8］ ZHAO Z J，ZOU C，ZHU Y X，et al．Development of L-tryptophan production strains by defined genetic modification in Escherichia coli［J］．J Ind Microb Biotechnol，2011，38(12)：1921-1929．

［9］ GU P，YANG F，LI F，et al．Knocking out analysis of tryptophan permeases in Escherichia coli for improving L-tryptophan production［J］．Appl Microb Biotechnol，2013，97(15)：6677-6683．

［10］ WANG J，CHENG L K，WANG J，et al．Genetic engineering of Escherichia coli to enhance production of L-tryptophan［J］．Appl Microb Biotechnol，2013，97(17)：7587-7596．

［11］ CHEN L，ZENG A P．Rational design and metabolic analysis of Escherichia coli for effective production of L-tryptophan at high concentration［J］．Appl Microb Biotechnol，2017，101(2)：559-568．

［12］ WEINER M，ALBERMANN C，GOTTLIEB K，et al．Fed-batchproduction of L-phenylalanine from glycerol and ammonia with recombinant Escherichia coli［J］．Biochem Eng J，2014，83：62-69．

［13］ LIU S P，LIU R X，XIAO M R，et al．A systems level engineered E．coli capable of efficiently producing L-phenylalanine［J］．Process Biochem，2014，49(5)：751-757．

［14］ SANTOS C N S，XIAO W，STEPHANOPOULOS G．Rational，combinatorial，and genomic approaches for engineering L-tyrosine production in Escherichia coli［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(34)：13538-13543．

［15］ PATNAIK R，ZOLANDZ R R，GREEN D A，et al．L-tyrosine production by recombinant Escherichia coli：fermentation optimization and recovery［J］．Biotechnol Bioeng，2008，99(4)：741-752．

［16］ WENDISCH V F．Amino acid biosynthesis-pathways，regulation and metabolic engineering［M］．Berlin：Springer，2007．

［17］ GOSSET G．Improvement of Escherichia coli production strains by modification of the phosphoenolpyruvate：sugar phosphotransferase system［J］．Microb Cell Fact，2005，4(1)：14-37．

［18］ 肖梦榕，张梁，石贵阳．改进莽草酸合成代谢的大肠杆菌工程化研究新进展［J］．微生物学报，2014，54(1)：5-13．

［19］ MARTíNEZ K，DE ANDA R，HERNáNDEZ G，et al．Coutilization of glucose and glycerol enhances the production of aromatic compounds in an Escherichia coli strain lacking the phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system［J］．Microb Cell Fact，2008，7(1)：1-12．

［20］ LU J，TANG J，LIU Y，et al．Combinatorial modulation of galP and glk gene expression for improved alternative glucose utilization［J］．Appl Microb Biotechnol，2012，93(6)：2455-2462．

［21］ SNOEP J L，ARFMAN N，YOMANO L P，et al．Reconstruction of glucose uptake and phosphorylation in a glucose-negative mutant of Escherichia coli by using Zymomonas mobilis genes encoding the glucose facilitator protein and glucokinase［J］．J Bacteriol，1994，176(7)：2133-2135．

［22］ WEISSER P，KRÄMER R，SAHM H，et al．Functional expression ofthe glucose transporterofZymomonasmobilisleads to restoration of glucose and fructose uptake in Escherichia coli mutants and provides evidence for its facilitator action［J］．J Bacteriol，1995，177(11)：3351-3354．

［23］ CHANDRAN S S，YI J，DRATHS K M，et al．Phosphoenolpyruvate availability and the biosynthesis of shikimic acid［J］．Biotech Prog，2003，19(3)：808-814．

［24］ ZHAO Z，CHEN S，WU D，et al．Effect of gene knockouts of L-tryptophan uptake system on the production of L-tryptophan in Escherichia coli［J］．Process Biochem，2012，47(2)：340-344．

［25］ GU P，YANG F，LI F，et al．Knocking out analysis of tryptophan permeases in Escherichia colifor improving L-tryptophan production［J］．Appl Microb Biotechnol，2013，97(15)：6677-6683．

［26］ LIU Q，CHENG Y，XIE X，et al．Modification of tryptophan transport system and its impact on production of L-tryptophan in Escherichia coli［J］．Bioresour Technol，2012，114：549-554．

［27］ KIKUCHIY，TSUJIMOTO K，KURAHASHIO．Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli［J］．Appl Environ Microb，1997，63(2)：761-762．

［28］ GER Y M，CHEN S L，CHIANG H J，et al．A single Ser-180 mutation desensitizes feedback inhibition of the phenylalaninesensitive 3-deoxy-σ-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP)synthetase in Escherichia coli［J］．J Biochem，1994，116(5)：986-990．

［29］ JOSSEK R，BONGAERTS J，SPRENGER G A．Characterization of a new feedback-resistant3-deoxy-σ-arabino-heptulosonate7-phosphate synthase AroF of Escherichia coli［J］．FEMS Microb Lett，2001，202(1)：145-148．

［30］ CALIGIURI M G，BAUERLE R．Subunit communication in the anthranilate synthase complex from Salmonella typhimurium［J］．Science，1991，252：1845-1848．

［31］ CALIGIURI M G，BAUERLE R．Identification of amino acid residues involved in feedback regulation of the anthranilate synthase complex from Salmonella typhimurium：evidence for an amino-terminal regulatory site［J］．J Biolog Chem，1991，266(13)：8328-8335．

［32］ BÁEZ-VIVEROS J L，OSUNA J，Hernández-Chávez G，et al．Metabolic engineering and protein directed evolution increase the yield of L-phenylalanine synthesized from glucose in Escherichia coli［J］．Biotech Bioeng，2004，87(4)：516-524．

［33］ NELMS J，EDWARDS R M，WARWICK J，et al．Novel mutations in the pheA gene of Escherichia coli K-12 which result in highly feedback inhibition-resistant variants of chorismatemutase/prephenate dehydratase［J］．Appl Environ Microb，1992，58(8)：2592-2598．

［34］ LÜTKE-EVERSLOH T，STEPHANOPOULOS G．L-tyrosine production by deregulated strains of Escherichia coli［J］．Appl Microb Biotechnol，2007，75(1)：103-110．

［35］ LÜTKEEVERSLOH T， STEPHANOPOULOS G．Feedback inhibition of chorismatemutase/prephenate dehydrogenase(TyrA)of Escherichia coli：generation and characterization of tyrosine-insensitive mutants［J］．Appl Environ Microb，2005，71(11)：7224-7228．

［36］ PANICHKIN V B，LIVSHITS V A，BIRYUKOVA I V，et al．Metabolic engineering ofEscherichia coliforL-tryptophan production［J］．Appl Biochem Microb，2016，52(9)：783-809．

［37］ SABIDO A，SIGALA J C，HERNÁNDEZ-CHÁVEZ G，et al．Physiological and transcriptional characterization of Escherichia coli strains lacking interconversion of phosphoenolpyruvate and pyruvate when glucose and acetate are coutilized［J］．Biotech Bioeng，2014，111(6)：1150-1160．

［38］ YAKANDAWALA N，ROMEO T，FRIESEN A D，et al．Metabolic engineering ofEscherichia coli to enhance phenylalanine production［J］．Appl Microb Biotechnol，2008，78(2)：283-291．［39］ CUI Y Y，LING C，ZHANG Y Y，et al．Production of shikimic acid from Escherichia coli through chemically inducible chromosomal evolution and cofactor metabolic engineering［J］．Microb Cell Fact，2014，13(1)：21-31．

［40］ 李光镐，朴惠民，李孝炯，等．具有增强L-色氨酸生产力的大肠杆菌微生物以及使用其生产L-色氨酸的方法：105143440A［P］．2015-12-09．

［41］ 赵志军，陈晟，吴丹，等．大肠杆菌色氨酸转运系统多基因敲除对色氨酸生产的影响［J］．生物工程学报，2011，27(12)：1765-1772．

［42］ TATARKO M，ROMEO T．Disruption of a global regulatory gene to enhance central carbon flux into phenylalanine biosynthesis in Escherichia coli［J］．Curr Microbiol，2001，43(1)：26-32．

［43］ LIU L，DUANABD X，WU J．Modulating the direction of carbon flow in Escherichia coli to improve L-tryptophan production by inactivating the global regulator FruR［J］．J Biotechnol，2016，231：141-148．

［44］ 赵春光，程立坤，徐庆阳，等．微生物法生产 L-色氨酸的研究进展［J］．发酵科技通讯，2008，37(4)：34-36．

［45］ LIU L，DUAN X，WU J．L-tryptophan production in Escherichia coli improved by weakening the pta-ackA pathway：［J］．PLoS ONE，2016，11(6)：e0158200．

［46］ ZHAO C，CHENG L K，WANG J，et al．Impact of deletion of the genes encoding acetate kinase on production of L-tryptophan by Escherichia coli［J］．Ann Microbiol，2016，66(1)：1-9．

(责任编辑 管珺)

Metabolic engineering of aromatic amino acids in Escherichia coli

YAN Fangqing1，HAN Yakun1，LI Juan1，LI Yanjun1，2，3，XU Qingyang1，2，3，CHEN Ning1，2，3，XIE Xixian1，2，3
(1．College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;2．National and Local United Engineering Laboratory of Metabolic Control Fermentation Technology，Tianjin 300457，China;3．Tianjin Engineering Laboratory of Efficient and Green Amino Acid Manufacture，Tianjin 300457，China)

Aromatic amino acids(AAAs)，including L-phenylalanine(L-Phe)，L-tyrosine(L-Tyr)and L-tryptophan(L-Trp)，are important essential amino acids in the organism，and have important biological functions and wide applications in the fields of pharmaceutic，food and feed industries so on．This paper introduces biosynthetic pathway and metabolic regulation of AAAs，and systematically summarizes the metabolic engineering strategies for the construction of Escherichia coli AAAs producing strains．In view of the problems in industrial production of AAAs at present，this paper prospects the further application of metabolic engineering strategies for the modification of AAAs producing strains．

aromatic amino acids;Escherichia coli;metabolic engineering

Q517;Q78

A

1672-3678(2017)05-0032-08

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．004

2017-06-06

天津市科技支撑计划重点项目(14ZCZDSY00015)

鄢芳清(1992—)，男，湖南娄底人，研究方向：代谢控制发酵;谢希贤(联系人)，教授，E-mail：xixianxie@tust．edu．cn