藏灵菇发酵乳中醋酸菌的多样性分析

张靖晞，赵欣，索化夷

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715;2.西南大学重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；3.重庆第二师范学院重庆市功能性食品协同创新中心，重庆 400067）

藏灵菇发酵乳中醋酸菌的多样性分析

张靖晞1,2，赵欣3，索化夷1,2

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715;2.西南大学重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；3.重庆第二师范学院重庆市功能性食品协同创新中心，重庆 400067）

对国内不同地区采集的8份藏灵菇发酵乳样品中醋酸菌进行分离鉴定，通过16S rDNA同源性分析和系统发育树分析来探究藏灵菇中醋酸菌的组成和遗传多样性。结果表明，共分离得到44株醋杆菌，分别为Acetobacter fabarum（20株）、Acetobacter orientalis（5株）和Acetobacter syzygii（19株）；Acetobacter fabarum和Acetobacter syzygii为藏灵菇发酵乳中的优势醋杆菌，且二者亲缘关系较近。序列分析显示Acetobacter fabarum菌株表现出良好的稳定性；而在Acetobacter syzygii中，共发现4个变异位点，在系统发育树中进化程度高；在Aceto⁃bacter orientalis中，共发现5个变异位点。

藏灵菇；醋杆菌；鉴定；多样性

0 引 言

藏灵菇发酵乳风味独特，带有轻微的醇香和起泡性，具有增强免疫力等，该发酵乳中醋酸菌对其品质形成具有重要作用[1]。醋酸菌主要分布于藏灵菇的表层，能维持藏灵菇中微生物共生体系的稳定[2]。

Gao研究发现，藏灵菇中微生物分属11个属[3]。李剑从藏灵菇发酵乳中分离出巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）、醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）和过氧化醋杆菌（Acetobacterperoxydans）[5]；曹宜从其中筛出 Aceto⁃bacter orientalis[6]；董健从其中分离出Acetobacter orientalis和Acetobacter okinawensis[7]；周龙霞从其中分离出Aceto⁃bacter peroxide和Acetobacter aceti[8]。以上研究表明，醋酸菌是藏灵菇发酵乳中微生物的重要组成之一。

本实验以8份藏灵菇样品为研究对象，对其分离、纯化所得菌株进行16S rDNA序列分析和系统发育树分析，以期为藏灵菇发酵乳中醋酸菌的组成及其遗传多样性的研究提供参考。

1 实验

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

8份藏灵菇样品采自西藏不同地区，保藏于西南大学食品科学学院，用ZLG01-ZLG08表示。实验中分离菌株编号说明，如ZLG01-1表示第一份藏灵菇样品发酵乳中分离出的第一株菌。

λDNA/HindⅢ，6× DNA Loading Buffer，100 bp DNA Ladder，溶菌酶，细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302），2×Taq PCR MasterMix；上游引物 27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3），下 游 引 物1495R（5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）；MRS肉汤，琼脂，琼脂糖，安佳脱脂乳粉。

1.1.2 仪器设备

洁净工作台（SW-CJ-2F），水浴恒温振荡器（DSHZ-300A），隔水式恒温培养箱（GHP-9160），生物显微镜（OLYMPUS-BX43），离心机（5810），梯度PCR仪（S1000 Thermal Cycler），小型水平电泳槽（Mini-Sub Cell GT），Gene Genius凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离与纯化

参照曹宜等[8]的方法并稍作修改，吸取相应稀释液100 μL涂布于MRS平板，30℃培养48 h。选择菌落数在30～300之间的平板，从中挑取菌落接种于MRS液体培养基，水浴30℃转速为150 r/min培养24 h，通过2～5次划线培养后获得纯菌落。

1.2.2 醋酸菌形态特征的观察

观察纯化菌株在MRS平板上的菌落形态。参照BENSALAH F等[9]的方法进行革兰氏染色、镜检。

1.2.3 16S rDNA序列扩增与系统发育树构建

参照华鹤良[10]的方法并稍作修改，PCR反应采用25 μL体系：模板 1 μL，27F（10 μmol/L）1 μL，1495R（10 μmol/L）1 μL，2× Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94 ℃（5 min）；94 ℃（40 s），55 ℃（40 s），72 ℃（1 min），共35个循环；72 ℃（10 min）。反应结束后，取5 μL PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，同时PCR产物测序、比对分析。使用Clustalx 1.83软件进行序列匹配比对，MEGA 5.0软件构建分离菌株的系统发育树，置信度检测采用自举法，自举数据集为1 000[11-13]。

2 结果与分析

2.1 醋酸菌的纯化与镜检

由图1可知，菌落呈淡黄色，表面湿润，不透明，菌落小而凸起，边缘整齐。由图2可知，菌株经革兰氏染色后，在显微镜下为红色，为革兰氏阴性菌，符合醋杆菌特征。细胞形态结构均一，表明为纯化菌株。

图1 菌株菌落形态

图2 分离菌株革兰氏染色结果（×1 000）

2.2 醋酸菌16S rDNA PCR扩增结果

分离菌株16S rDNA按照PCR反应条件扩增和琼脂糖凝胶电泳检测后，在凝胶成像系统中观察结果如图3，分离菌株16S rDNA基因扩增产物在1500 bp附近出现一条清晰、明亮的条带，无异常，阴性对照无条带，与预期结果一致，PCR扩增成功。

图3 部分分离菌株PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 醋酸菌16S rDNA同源性比对与系统发育树分析

将44株分离菌株测序结果与GenBank中已有序列进行比对分析，结果表明分离菌株同源性均在99%以上，大于分类研究阈值97%[14]，其中Acetobacter fabarum 20株、Acetobacter orientalis 5株和Acetobacter syzy⁃gii 19株。图4为8个样品中分离菌株种类分布及数量情况，由图可知ZLG08分出菌株最多，包括3个种的醋杆菌，分别为Acetobacter fabarum、Acetobacter orientalis和Acetobacter syzygii，是本实验采集样品中唯一分出这3种菌种的样品。ZLG05和ZLG07样品分出的醋杆菌种类单一，只含Acetobacter syzygii；其中，ZLG07样品分出数量最少，只有2株。而Acetobacter syzygii在87.5%（7份）的样品中被发现，仅ZLG02中未被发现。Aceto⁃bacter fabarum在62.5%（5份）的样品中被发现，其中Ace⁃tobacter fabarum和Acetobacter syzygii同时存在于50%（4份）的样品中，在所有样品中该组合出现频率较高。Acetobacter orientalis仅在37.5%（3份）的样品中被发现，分别为ZLG02、ZLG03和ZLG08。

基于分离菌株16S rDNA序列构建系统发育树结果如图5所示，由图可知，44株分离菌株与参考菌株以非常高的自举支持率聚在同一分支上，共包括醋杆菌属中的3个种，分别为Acetobacter fabarum（20株）、Ace⁃tobacter orientalis（5株）和 Acetobacter syzygii（19株），与16S rDNA序列比对分析结果一致。图中各分支长度的大小代表物种进化程度的高低，3个种属中Aceto⁃bacter orientalis的进化程度高于Acetobacter fabarum和Ace⁃tobacter syzygii，与 Acetobacter orientalis相比，Acetobacter fabarum和Acetobacter syzygii的进化程度接近，亲缘关系较近。此外，进化树分析表明Acetobacter fabarum与Ace⁃tobacter lovaniensis和Acetobacter ghanensis的亲缘关系近；Acetobacter syzygii与Acetobacter okinawensis的亲缘关系近；而Acetobacter orientalis与Acetobacter cibinongensis的亲缘关系近。序列匹配分析结果显示Acetobacter fabarum菌株表现出良好的稳定性，而Acetobacter syzygii中的ZLG03-4在第641位点上碱基由G突变为T；ZLG07-2在第226位点上碱基由A突变为C、第227位点上碱基由A突变为T和第465位点上碱基由G突变为T，在系统发育树中二者的进化程度高。Aceto⁃bacter orientalis中的ZLG02-7在第158位点上碱基由T突变为C；ZLG03-1在第1350位点上碱基由C突变为G；ZLG08-5在第154位点上碱基由A突变为C、第158位点上碱基由T突变为C、第1352位点上碱基由A突变为G。

图4 各样品中分离菌株的情况

4 讨 论

（1）本研究从8份西藏不同地区藏灵菇的发酵乳中均筛选出醋酸杆菌，共44株，分属Acetobacter orienta⁃lis，Acetobacter fabarum 和Acetobacter syzygii，而醋酸菌在发酵过程中具有很强的活性和酸化作用，其能利用多种糖类产生有机酸，如乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、丙酮酸和琥珀酸等，在发酵产品品质的形成中发挥重要作用。研究表明，Acetobacter orientalis是参与乳糖酸生产的主要微生物，在以牛乳为原料的发酵过程中，Ace⁃tobacter orientalis主要表现为氧化乳糖作用，在发酵乳表层10mm范围内可积累大量乳糖酸[15-17]。乳糖酸不仅具有很强的香味，而且可以缩短成熟时间和促进风味产生；因其自身结构中带有8组氢氧水基，因此可抓住大量的水，从而在发酵乳品质形成中发挥重要作用[18]；此外，其能促进肠道对矿物质的吸收和抗氧化等功能[19]。因此Acetobacter orientalis可能对研究藏灵菇发酵乳的品质和功能的形成息息相关。

（2）16S rDNA在结构与功能上具有高度保守性，但在特殊条件的作用下，其基因序列也会发生一定程度的突变。本实验中Acetobacter fabarum表现出良好的稳定性；在Acetobacter syzygii中，共发现4个变异位点；在Acetobacter orientalis中，共发现5个变异位点。这可能是由于青藏高原极端的气候条件、地理位置和长期选择进化而成。而碱基位点变异菌株的存在可能引起藏灵菇发酵乳品质与风味的变化；如发酵乳中有碱基变异位点的Acetobacter syzygii和Acetobacter orientalis组织形态良好，乳清不易析出，风味较佳或者产乳糖酸能力强等特点，则可考虑将这些变异位点作为特殊的遗传标记。以上推测还需要进一步实验用更多分离菌株加以验证，但本实验结果可为研究藏灵菇发酵乳中醋酸杆菌的遗传多样性提供一定参考。

图5 分离菌株16S rDNA的系统发育树

（3）在开菲尔粒及其发酵乳研究中，Miguel[20]应用培养和非培养方法相结合分析不同地区开菲尔乳中细菌的组成，从中发现巴西（圣卡塔琳娜州）样品中存在Acetobacter syzygii；Korsak[21]从开菲尔乳中还发现Ace⁃tobacter orientalis和Acetobacter lovaniensis的存在。此外，相关研究表明醋酸菌在发酵乳品质形成和功能特性中具有重要作用。在开菲尔粒中乳酸菌、酵母菌和醋酸菌为主要菌群，三者相互共生。具体为乳酸菌利用乳糖产生乳酸使奶酸化，同时促进酵母菌生长；酵母菌的生长为乳酸菌和醋酸菌提供发育促进物质；而醋酸菌合成的维生素对酵母菌和乳酸菌的生长也起促进作用；乳酸菌利用乳糖分解产生的葡萄糖形成荚膜多糖，促进开菲尔乳品质的形成。藏灵菇虽与国外开菲尔粒有所不同，但属于开菲尔品系，其微生物组成存在一定相似性。因此，可借鉴国外对开菲乳粒的相关研究方法解析我国藏灵菇中微生物的多样性，促进藏灵菇中微生物的开发和功能特性的研究。

5 结 论

通过8份西藏不同地区藏灵菇发酵乳中醋酸菌筛选结果可知，Acetobacter fabarum和Acetobacter syzygii为主要优势菌种，在少数样品中分离到Acetobacter orienta⁃lis，这可能与藏灵菇形成中的发酵条件和区域差异有关。序列分析结果表明，虽然受青藏高原极端的气候条件和自然长期的选择与驯化，Acetobacter fabarum菌株仍然表现出良好的稳定性。而Acetobacter syzygii中ZLG03-4在第641位点上碱基由G突变为T；ZLG07-2在第226位点上碱基由A突变为C、第227位点上碱基由A突变为T和第465位点上碱基由G突变为T，在系统发育树中二者的进化程度较其他Aceto⁃bacter syzygii高；此外，Acetobacter orientalis中ZLG02-7在第158位点上碱基由T突变为C；ZLG03-1在第1350位点上碱基由C突变为G；ZLG08-5在第154位点上碱基由A突变为C、第158位点上碱基由T突变为C、第1352位点上碱基由A突变为G。这可为研究西藏不同地区藏灵菇发酵乳的风味和品质差异提供参考。

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Diversity analysis of acetic acid bacteria isolated from Tibetan kefir dairy

ZHANG Jingxi1，2,ZHAO Xin3,SUO Huayi1，2

(1.Food Science Department,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,Chongqing 400715,China；3.Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

Acetic acid bacteria from the eight samples of Tibetan kefir dairy,which collected from different regions in China were isolated and identified by 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree analysis,aimed to explore the acetobacter composition and genetic diversity in Tibetan kefir.The results of the identification included Acetobacter fabarum(20 strains),Acetobacter orientalis(5 strains)and Acetobacter syzygii(19 strains).Acetobacter fabarum and Acetobacter syzygii,which hadclose relationship,were themain Acetobacter in Tibetan kefir dairy.Sequence analysis shown that Acetobacter fabarum has a good characteristic of stability.Four mutations were tested and the strains with mutations had highdegreeof evolution in Acetobacter syzygii.In addition,5 mutations were tested inAcetobacter orientalis.

Tibetan kefir;Acetobacter;Identification;Diversity

Q93-331

A

1001-2230（2017）08-0004-05

2017-01-13

国家公益性行业（农业）科研专项(201303085)；重庆市社会民生科技创新专项(cstc2015shmszx80021)；中央高校基本业务费项目(xdjk2016A018)。

张靖晞(1996-)，女，本科，研究方向为食品科学。

索化夷