乳制品中三聚氰胺的免疫亲和凝胶柱检测方法

齐玉杰，生威，王俊平，张燕，王硕

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

乳制品中三聚氰胺的免疫亲和凝胶柱检测方法

齐玉杰，生威，王俊平，张燕，王硕

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

为建立用于检测乳制品中三聚氰胺的免疫亲和凝胶柱检测方法，本研究采用活化酯法制备三聚氰胺酶标抗原，将三聚氰胺抗体、HRP抗体分别与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备相应的抗体胶作为检测层和质控层，方法检测限为200 μg/L。选取牛奶、奶粉、发酵乳等乳制品进行检测，测得所检样品中三聚氰胺的检测限为1 mg/kg。该方法具有良好的特异性，除与环丙氨嗪存在一定的交叉反应外，与其他3种结构类似物和6种常用兽药没有交叉反应。该检测方法操作简便，结果判断容易，整个检测过程约15 min，可用作三聚氰胺现场快速检测的有效手段。

免疫亲和凝胶检测柱；三聚氰胺；乳制品

0 引 言

三聚氰胺[1]，俗称密胺、蛋白精，是一类重要的有机化工原料，在木材、塑料、造纸、纺织、皮革等行业有广泛的应用。由于其价格低廉被一些不法企业违规使用到食品中，以达到检测中蛋白质含量达标或超标的假象，导致人们食用后出现若干不良反应，严重时甚至危及生命。2011年我国卫生部联合5个部门发布第10号公告，明确规定各类乳制品中三聚氰胺的限量值，凡是高于此标准的食品一概严禁销售[2]。目前，检测食品中三聚氰胺的方法有HPLC[3-5]、LC-MS/MS[6-8]、GC-MS[9]、拉曼光谱法[10-11]、ELISA[12]、胶体金免疫层析法[13-15]等。本研究建立的检测食品中三聚氰胺的免疫亲和凝胶检测柱方法，具有操作简单、检测快速、结果可视化、定性半定量的特点，适用于大量样品中三聚氰胺的现场初步筛查。

1 实验

1.1 仪器设备

超纯水系统，蛋白纯化仪，紫外分光光度计，磁力搅拌器，周转式振摇器，旋涡混合器，冷冻离心机，真空泵，具砂板层析柱，无填料SPE小柱（1 mL），聚乙烯垫片。

1.2 药品

三聚氰胺，环丙氨嗪，三聚氰酸，阿特拉津，呋喃它酮，诺氟沙星，磺胺喹恶啉，氯霉素，庆大霉素，四环素，辣根过氧化物酶（HRP），溴化氰活化的琼脂糖凝胶，HRP抗体，三聚氰胺抗体。

1.3 常用溶液的配制

（1）偶联缓冲液。准确称取7.3 g NaCl，2.1 g NaHCO3，加入250 mL超纯水，用NaOH调pH至8.3。

（2）封闭液。称取0.6 g甘氨酸，加入20 mL偶联缓冲液溶解，放置4℃保存备用。

（3）醋酸缓冲液。准确称取5.84 g NaCl，0.9 g CH3COONa，1.16 mL CH3COOH，加入200 mL超纯水。

（4）溶胀酸液（浓度1 mmol/L的HCL）。量取0.5 mL浓度为1 mol/L盐酸，加入500 mL超纯水。

（5）底物显色液（TMB-过氧化氢脲溶液）。

底物液A：称取无水醋酸钠4.1 g，β-环糊精1.25 g，柠檬酸1.58 g，过氧化氢脲214.5 mg，加超纯水至500 mL，4℃保存，使用时需要事先恢复至室温。

底物液B：称取100 mg TMB，加入10 mL DMSO溶解，室温避光保存。

使用前15 min混合：12.43 mL A溶液和0.075 mL B溶液。

（6）磷酸盐缓冲溶液（PBS，浓度0.05 mol/L，pH 7.4）。 称 取 Na2HPO4·12H2O 13.76 g，NaH2PO4·2H2O 1.794 g，NaCl 9.0 g，溶于1 000 mL超纯水。

1.4 方法

1.4.1 酶标抗原（MEL-HRP）的制备

三聚氰胺半抗原由本实验室提供，采用活化酯法与HRP偶联制备酶标抗原。具体操作：称取三聚氰胺半抗原1.0 mg置于棕色瓶中，加入1.0 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），之后加入100 μL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）使其溶解，再加入1.4 mg N,N-二环已基碳二亚胺（DCC），置于4℃条件下搅拌反应20 h，这个过程中会出现浑浊，反应结束后于4℃，4 500 r/min离心10 min，取上清液。取5.0 mg的HRP加入到2.0 mL的PBS缓冲溶液（浓度0.01 mol/L，pH=8.5）溶解，此为HRP蛋白溶液。然后将上清液在冰浴条件下逐滴缓慢加入到HRP蛋白溶液中，搅拌过夜。结束后取出反应液用PBS缓冲溶液4℃透析3 d，收集透析后溶液加等体积甘油，保存备用。

1.4.2 免疫亲和凝胶检测柱的制备

（1）封闭胶的制备。称取1.0 g溴化氰活化的琼脂糖凝胶，加入80 mL浓度为1 mmol/L的HCl溶液于小烧杯中，用玻璃棒充分搅拌溶解。先用约10 mL HCl溶液对具砂板层析柱进行清洗，将溶胀充分的凝胶转移其中，继续用大概200 mL HCl溶液清洗凝胶，然后用约30 mL偶联缓冲液冲洗凝胶。再加入9 mL甘氨酸封闭液，室温下在定向摇床上振摇反应2 h，反应完后依次用偶联缓冲液、醋酸缓冲液清洗3次，每次10 mL，最后再用偶联缓冲液清洗一次。最后抽空，用约10 mL的PBS缓冲溶液将制备好的封闭胶重新悬起，加入3 μL的proclin 300抑菌素，置于4℃保存备用。

（2）三聚氰胺抗体胶的制备。将三聚氰胺抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备抗体胶用作检测层。具体步骤为称取0.25 g溴化氰活化的琼脂糖凝胶，加入40 mL浓度为1 mmol/L的HCl溶液于小烧杯中，用玻璃棒充分搅拌溶解。先用约10 mL的HCl溶液对具砂板层析柱进行清洗，将溶胀充分的凝胶转移其中，继续用大概200 mL的HCl溶液清洗凝胶，然后用约30 mL偶联缓冲液冲洗凝胶。取0.5 mg三聚氰胺抗体，加入1～2 mL偶联缓冲液进行稀释，混合均匀后转移到柱子中，并于室温振摇反应2 h。然后用10～20 mL偶联缓冲液清洗凝胶，以去除多余的抗体。再加入3.5 mL甘氨酸封闭液，室温下在定向摇床上振摇反应2 h。应完后依次用偶联缓冲液、醋酸缓冲液清洗3次，每次10 mL，最后再用偶联缓冲液清洗一次。最后抽空，用约5 mL PBS缓冲溶液将制备好的抗体胶重新悬起，加入1.5 μL proclin 300抑菌素，置于4℃保存备用。

（3）HRP抗体胶的制备。将HRP多克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备HRP抗体胶用作质控层。制备步骤同1.4.2.2三聚氰胺抗体胶的制备。

1.4.3 免疫亲和凝胶检测柱分析方法的建立

（1）三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱的组装及检测步骤。免疫亲和凝胶检测柱由上下两部分组成，检测层在上，质控层在下，两层之间有一个约2 mm的空气隔层。将150 μL封闭胶按一定比例混合的HRP抗体胶由SPE小柱上部加入到底部的聚乙烯垫片上，用注射器沥干缓冲液，加入第二个垫片，力度以紧密接触凝胶且又不对其造成挤压为宜。在距离下层垫片约2 mm处放置第三个聚乙烯垫片，将150 μL封闭胶按一定比例混合的三聚氰胺抗体胶加入到聚乙烯垫片上，用注射器沥干缓冲液，最后固定第四个聚乙烯垫片，完成检测柱的组装。

检测步骤：按上述方法组装好检测柱，用PBS缓冲溶液清洗两次，每次清洗体积为1 mL。将PBS缓冲溶液按一定比例稀释酶标抗原与标准品或样品溶液，取1 mL混合溶液以1 mL/min的流速通过检测柱。然后用3 mL的PBST缓冲溶液和2 mL PBS缓冲溶液清洗检测柱，目的是除去干扰实验的残留物。最后取300 μL底物溶液加入到检测柱中，与检测层和质控层充分反应30 s后推出，观察4 min内检测柱上下层的显色情况。

（2）三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱工作条件的优化

①酶标抗原最低稀释比例的确定。从SPE柱的进样口加入150 μ L封闭胶到底部的聚乙烯垫片上，用注射器把缓冲液打出后放入第二个聚乙烯垫片。用PBS缓冲溶液对酶标抗原进行稀释，稀释比例分别为 1∶1 000，1∶5 000，1∶10 000，1∶50 000，1∶10 0000，1∶50 0000，取1 mL酶标抗原溶液加入到检测柱中，用注射器在1 min内匀速排出，最后加入底物反应30 s后排出，观察4 min内凝胶层的颜色变化，当封闭胶无色时，说明没有非特异性吸附，此时酶标抗原的稀释比例为其最低稀释比例。

②抗体胶及酶标抗原最佳稀释比例的优化。将三聚氰胺抗体胶和封闭胶分别按不同比例1∶4，1∶9，1∶19(体积比)进行混合，酶标抗原选取最低稀释比例以上的几组数据，两者任意组合进行优化，按检测步骤操作，观察4 min内检测层的颜色变化，当检测层的蓝色清晰且梯度明显时，此时三聚氰胺抗体胶和酶标抗原的稀释比例分别为其最佳稀释比例。

③HRP抗体胶最佳稀释比例的优化。在上述已确定的条件基础上，将HRP抗体胶与封闭胶分别按不同比例1∶9，1∶49，1∶99，1∶149，1∶199(体积比)进行混合，同上述检测步骤，选择与检测层显色一致时，HRP抗体胶稀释比例为质控层的最佳稀释比例。

④样品稀释液的优化。按优化好的条件组装检测柱，分别用不同pH值（5.7，7.4，8.5）的PBS和PBST缓冲溶液稀释三聚氰胺标准品，经检测柱分析，探究不同稀释液对显色情况及检测限的影响，进而选择出最佳的样品稀释液。

（3）免疫亲和凝胶检测柱检测限的确定。选择上述已优化确定的工作条件按要求组装检测柱，建立三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱分析方法，分别检测不同浓度的三聚氰胺标准品溶液，以目测检测层颜色消失时，对应的三聚氰胺的最低浓度定义为三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱分析方法的检测限。

（4）免疫亲和凝胶检测柱特异性实验。本实验选取环丙氨嗪、三聚氰酸、阿特拉津、三聚氯氰4种结构类似物，以及呋喃它酮、诺氟沙星、磺胺喹恶啉、氯霉素、庆大霉素、四环素6种其他种类的兽药进行特异性实验。

（5）免疫亲和凝胶检测柱实际样品的检测。

本实验选取牛奶、发酵乳和奶粉等乳制品进行检测，牛奶不需要经过复杂的前处理，稀释5倍即可直接用于检测。发酵乳采用稀释和离心的方法，具体步骤为取1 mL发酵乳，加入2 mL样品稀释液，高速漩涡混匀，10 000 r/min，4℃，离心10min，取上清液稀释2.5倍后用于检测。奶粉的具体处理步骤为称取1 g奶粉，加入2.5 mL样品稀释液，高速漩涡混匀，10 000 r/min，4℃，离心10 min，取上清液稀释2倍进行检测。

2 结果和讨论

2.1 工作条件的优化

2.1.1 三聚氰胺抗体胶和酶标抗原稀释比例的优化

为消除封闭胶的影响需要对酶标抗原的稀释比例进行优化，实验发现，当酶标抗原的稀释比例为1∶5 000，凝胶层不显示蓝色，表明此稀释比例下，酶标抗原与封闭胶之间没有发生非特异吸附反应，因而确定酶标抗原的最低稀释比例为1∶5 000，在此基础上对三聚氰胺抗体胶和酶标抗原的稀释比例继续进行优化，结果如表1所示了。由表1可以看出，随着酶标抗原和抗体胶稀释比例的增大，检测层颜色也逐渐变浅。当三聚氰胺抗体胶与封闭胶的混合比例为1∶4，酶标抗原的稀释比例为1∶10 000以及三聚氰胺抗体胶与封闭胶的混合比例为1∶9，酶标抗原的稀释比例为1∶5 000时，检测层显色适当便于观察，且前者较后者梯度更加明显，检测限更低。综合考虑显色情况、方法灵敏度，最终选择三聚氰胺抗体胶与封闭胶的混合比例为1∶4，酶标抗原的稀释比例为1∶10 000。

表1 三聚氰胺抗体胶和酶标抗原稀释比例的优化结果

2.1.2 HRP抗体胶最佳稀释比例的优化

在三聚氰胺抗体胶与酶标抗原的稀释比例确定的基础上后，按照空白对照，质控层与检测层颜色保持一致的原则，优化质控层HRP抗体胶的稀释比例。结果显示，当HRP抗体胶与封闭胶的混合比例为1∶149时，符合实验要求。图1为质控层和检测层的优化结果。

图1 质控层和检测层优化结果

2.1.3 样品稀释液的优化

本研究分别选择pH值为5.7，7.4，8.5的PBS缓冲溶液和PBST缓冲溶液稀释三聚氰胺标准品，质量浓度为0和200 μg/L，以最优工作条件组装检测柱进行检测，结果如图2和图3所示。实验发现，当选择pH值为5.7的PBST缓冲溶液时，此时检测柱上下层颜色适中便于观察，且三聚氰胺质量浓度为200 μg/L，检测柱上层消色。而当选择pH值为5.7和7.4的PBS缓冲溶液和pH值为7.4的PBST缓冲溶液，且当三聚氰胺质量浓度为200 μg/L时，检测柱上层有轻微蓝色，没有完全消线。选择pH值为8.5的PBS缓冲溶液和PBST缓冲溶液时，检测柱整体颜色较浅，且三聚氰胺浓度为200 μg/L时，检测柱上层蓝色没有完全消失。因而选择pH值5.7的PBST溶液作为三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱的最佳样品稀释液。

图2 不同pH值的PBS优化结果

图3 不同pH值的PBST优化结果

2.2 三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱检测限的确定

以最优工作条件组装检测柱，依次加入三聚氰胺质量浓度为0，50，100，200 μg/L；可以看出，当三聚氰胺质量浓度为200 μg/L时，检测层上层的蓝色完全消失，因此确定三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱的检测限为200 μg/L（图4）。从左至右依次为0 μg/L 50 μg/L 100 μg/L 200 μg/L

图4 三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱方法检测限

2.3 三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱特异性实验

本研究选择4种三聚氰胺结构类似物，分别为环丙氨嗪、三聚氰酸、阿特拉津、三聚氯氰，以及6种其他种类兽药，分别为呋喃它酮、诺氟沙星、磺胺喹恶啉、氯霉素、庆大霉素、四环素进行交叉反应实验，其中三聚氰胺与环丙氨嗪的质量浓度为200 μg/L，其他物质的质量浓度均为20 mg/L。由图6可以看出，除与环丙氨嗪存在一定的交叉反应外，与其他药物均没有交叉反应，表明本实验所研制的检测柱具有良好的特异性。

图5 与结构类似物和其他种类兽药的交叉反应

2.4 三聚氰胺免疫亲和凝胶检测柱实际样品的检测

本研究选取牛奶、发酵乳、奶粉等乳制品作为检测样品，按1.4.3.5对样品进行前处理，实验确定待测样品经5倍稀释即可消除基质影响，依次加入三聚氰胺浓度为0 mg/kg、1 mg/kg，由图7可以看出，当三聚氰胺浓度为1 mg/kg时，检测柱上层的颜色完全消失，因此确定乳制品中三聚氰胺的检测限为1 mg/kg。

图6 乳制品中三聚氰胺的检测限

3 结 论

本实验研究建立乳制品中三聚氰胺的免疫亲和凝胶检测柱分析方法，方法检测限为200 μg/L。该检测柱具有良好的特异性，除与环丙氨嗪有一定的交叉反应外，与其他结构类似物和兽药均没有交叉反应。针对乳制品中三聚氰胺的检测限为1 mg/kg。本方法检测快速，样品前处理简单，结果易于判断。牛奶样品仅需稀释就可直接检测，用时少，约15 min即可完成整个样品处理和检测过程，适合乳制品中三聚氰胺的现场快速检测，具有良好的应用前景。

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Gel-based immunoaffinity test columnmethod for the detection of melamine in dairy products

QI Yujie,SHENG Wei,WANG Junping,ZHANG Yan,WANG Shuo

(Tianjin University of Science and Technology,College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin 300457，China)

A new gel-based immunoaffinity test column method for detecting melamine in the dairy productswas developed.MEL-HRPcon⁃jugatewas prepared using activated ester method.Melamine antibody and HRP antibody were coupled with the CNBr-activated agarose gel to prepare the test layer and control layer,respectively.The limit of detection(LOD)of this assay was 200 μg/L,and the LOD of melamine in dairy products was 1 mg/kg.The method has good specificity,it showed no cross-reactivity with the structural analogues and other veteri⁃nary drugsexcept cyromazine.This method is simple and easy to judge the result,the entire detection process can be finished within 15 min,which can be used as a usefull tool for the detection of melamine.

gel-based immunoaffinity test column;melamine;dairy products

TS252.7

A

1001-2230（2017）08-0047-04

2016-12-20

“十二五”科技支撑计划(2013BAD18B11)；国家国际科技合作专项项目(2014DFR30350)。

齐玉杰（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品安全检测。

王硕