液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中12种水溶性维生素

耿健强，赵丽，潘红艳，邵明媛，王浩

（国家食品质量安全监督检验中心，北京市食品安全监控和风险评估中心，北京100094）

液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中12种水溶性维生素

耿健强，赵丽，潘红艳，邵明媛，王浩

（国家食品质量安全监督检验中心，北京市食品安全监控和风险评估中心，北京100094）

建立了同时测定婴幼儿配方奶粉中多种维生素、牛磺酸等12种水溶性维生素的液相色谱串联质谱测定法。采用MGⅢ-C18色谱柱，以质量分数为0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相（梯度洗脱），流速为0.25 mL/min，柱温25℃，进样量5 μL。方法检出限0.0001～1 mg/kg，高、中、低不同质量分数加标回收率85.0%～95.5%，相对标准偏差为2.9%～9.1%。该法具有样品预处理简单,灵敏度高,分析时间短等优点,适用于婴幼儿配方奶粉中上述12种水溶性维生素的同时测定。

高效液相色谱仪；婴幼儿配方奶粉；水溶性维生素

0 引 言

水溶性维生素是婴儿配方奶粉的重要组成部分，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。目前我国国标只能对单一或两三种水溶性维生素进行检测，其中，牛磺酸、VB1、VB2、VB3、VB6主要用高效液相测定；VB5、VB9、VH和VB12主要用微生物法测定。这些方法前处理繁琐，检测周期长，成本高，不能满足多种物质快速同时检测的要求。本文采用液质联用法同时对婴幼儿配方乳粉中12种水溶性维生素测定，定量采用了作者独创的测定液标准溶液加入定量法，克服了液质法定量中经常存在的基质效应，该方法准确、灵敏，适用于大批量样品的快速检测。

1 实 验

1.1 仪器与设备

Agilent 6410型串联三重四极杆质谱仪，配Agi⁃lent1200型液相色谱仪，KQ-5200型超声波清洗仪，Milli-Q去离子水发生器。

1.2 试剂与材料

甲醇，乙腈，盐酸，氢氧化钠，氨水，以上均为分析纯。

VB1，VB2，VB3，VB5，VB6，VB9(叶酸)，VB12，VH，牛磺酸。

样品购自本地超市。

1.3 方法

标准储备液的配制：分别称取适量的烟酸和烟酰胺标准品，分别用超纯水配成2.5 mg/mL的标准储备液。称取适量的泛酸标准品，用超纯水配成1.0 mg/mL标准储备液。称取适量的维生素B1(硫胺素)标准品用浓度为0.01 mol/L盐酸溶液溶解后，用超纯水配成质量浓度为0.5 g/L标准储备液。称取适量的VB2(核黄素)标准品，用浓度为2 mol/L盐酸溶液溶解后，用超纯水配成质量浓度为0.5 g/L标准储备液。称取适量的叶酸标准品，用适量水润湿，加入质量分数为10%氨水溶液至完全溶解后，用超纯水配成质量浓度为0.1 g/L标准储备液。分别称取适量的吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺，VB12和生物素标准品，分别用超纯水配成质量浓度为1.0 g/L标准储备液。称取适量的牛磺酸标准品，用超纯水配成质量浓度为10.0 g/L标准储备液。

标准工作溶液的配制：分别吸取上述适量的标准储备液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成烟酸、烟酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、VB9(叶酸)、VB12(氰钴胺)、VH（生物素）、牛磺酸质量浓度为 250，250，200，25，50，25，25，25，5，0.25，1.5，1 500 g/mL标准工作溶液

1.4 色谱条件

色谱柱：资生堂 MGⅢ-C18柱，5 μm，2.0 mm×150 mm。

条件：流速0.25 mL/min，柱温25 ℃，进样量5μL，流动相：0.1%甲酸水溶液（A）+甲醇（B）。 梯度洗脱：0～5 min,B 由5%线性递增至95%，5～10 min，B保持95%，10.0～10.1 min，B由95%线性递减至5%，10.1～15.0 min，B保持5%。

1.5 质谱分析条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正离子模式（牛磺酸为负离子模式）；检测方式为多反应检测；干燥气为N2；雾化气压力为275.8 kPa；干燥气流速为8 L/min；汽化温度为340℃；其质谱参数和保留时间如表1所示。

表1 质谱参数和保留时间

1.6 样品处理

准确称取5 g样品，用25.0 mL（50℃）热水溶解，超声10 min，用浓度为5 mol/L盐酸溶液调节pH值至1.7，放置2 min后，再用浓度为2.5 mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值至4.5。将样品溶液移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度后，倒入漏斗用快速定性滤纸自然过滤，弃去最初滤液，在50 mL锥形瓶中收集滤液，并充分混匀，滤液过0.22 m有机滤膜，待测。

1.7 定性定量方法

采用标准物质的保留时间及定性定量离子对比例对样品峰进行准确定性；因为奶粉样品基质复杂，如果用纯标定量，基质效应较大，所以本方法根据样品的标示值，在1.5 mL进样瓶中用标准工作溶液对测定液依次配制不同浓度的样品标准溶液进样分析,以质量浓度(μg/mL)为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，通过比较测定液和加标溶液目标化合物的差值，计算出测定液中12种水溶性维生素的含量。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件选择

水溶性维生素易溶于水，不溶于脂肪和有机溶剂，易分解。根据这12种水溶性维生素的化学特性，本研究先采用50℃热水充分溶解乳粉，超声提取10 min，为了充分破坏样品中的蛋白质，再加入酸溶液调节pH值至1.7，放置2 min后，再用2.5 mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值至4.5。经过反复试验，这种前处理的方法简便快速，加标回收率高（平均加标回收率＞85%），可以满足方法学检测要求。

2.2 色谱条件的优化

色谱柱的选择：为了有利于色谱峰的分离及锋形的改善，本方法分别采用资生堂MGⅢ-C18色谱柱(150 mm × 2.0 mm,5 μm)、ZORBAX Eclipse XDB-C1 8色谱柱和ZORBAX SB-Aq色谱柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm）进行分离试验，发现资生堂MGⅢ-C18色谱柱(150 mm × 2.0 mm,5 μm)效果较好。

流动相的选择：烟酸、烟酰胺、牛磺酸、VB1、VB6（包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺）属于强极性化合物，在反相C8柱上保留较弱，而泛酸、叶酸、VB12、生物素为中等极性化合物，为了有利于色谱峰的分离及峰形的改善，本方法采用0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相，利用梯度洗脱的方法提高分离效果，测试开始时，流动相中0.1%甲酸水溶液-甲醇的比例为95∶5，然后在0～5 min改变二者的比例为5∶95，这一部分主要是洗脱测定液中烟酸等极性较强的目标化合物，5～10 min内保持此比例，这一部分主要是洗脱测定液中的中这一部分主要是洗脱测定液中泛酸等中等极性目标化合物。通过上述两步梯度，在10 min内，可以较好的分离测定液中12种水溶性维生素（烟酸、烟酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、叶酸、VB12、生物素、牛磺酸）（结果如表1所示）。

2.3 质谱条件的优化

采用直接进样方式分别将质量浓度为1 μg/mL的12种水溶性维生素（烟酸、烟酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、叶酸、VB12、生物素、牛磺酸）分别注入离子源中，在正离子（牛磺酸为负离子）检测方式下进行母离子全扫描，得到12种水溶性维生素的分子离子峰。根据欧盟2002/657/EC指令规定对于质谱确证方法必须达到4个确证点的要求,低分辨液相色谱-质谱联用仪检测应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子。分别以该离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，最后采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，然后再对得到的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，使定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳。最终得到12种水溶性维生素的最佳质谱参数，结果如表1所示。

2.4 标准曲线线性范围

将样品加标溶液分别进样5 μL，测定结果经线性回归。线性范围：烟酸、烟酰胺为 0.2 ～10.0 μg/mL, 泛酸为 0.1～7.5 μg/mL，维生素B1为0.1～1.0 μg/mL；维生素B2为0.1～2.0 μg/mL、吡醛醛、吡哆醇、吡哆胺为0.05～1 μg/mL；叶酸为0.1～10 ng/mL；维生素B12为0.1～10.0 ng/mL；生物素为5～50 ng/mL；牛磺酸为1～50 μg/mL。回归方程（y为峰面积；x为质量浓度，μg/mL）相关系数和检出限如表2所示。

2.5 方法的回收率和精密度

称取已知含量的同一样品6份,每份5.00 g,分别添加三个浓度的标准品,按供试品制备方法处理后,进行测定,结果如表3所示。从表中可看出,样品加标回收率85.0%～95.5%,平均相对标准偏差为2.9%～9.1%（n=6）。

2.6 实际样品的测定

表2 12种水溶性维生素的回归方程、相关系数及检出限

运用本方法对市场购买的5种品牌的婴幼儿配方奶粉进行检测，测定结果见表4。维生素实际测定含量与标示值相符，均符合我国食品安全国家标准GB 10765-2010《婴幼儿配方食品》和GB 10767-2010《较大婴幼儿配方食品》。

表3 样品中12种水溶性维生素的的回收率与相对标准偏差

（续表3）

3 结 论

本文建立了液相色谱串联三重四级杆质谱同时测定婴幼儿配方奶粉中烟酸、烟酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、叶酸、VB12、生物素、牛磺酸的快速定性定量方法。该法分析时间小于10 min，其线性关系良好（r＞0.999）,检出限在 0.0001～1 mg/kg之间。在3个水平添加回收率试验，每个水平重复6次，其平均回收率在85.0%～95.5%之间，测定结果的相对标准偏差小于10%。该方法快速准确，可靠，并且灵敏度高，有望应用于婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素含量的同步定性定量测定。

[1]GROM O L,VASILCHUK T O,SHUMELIANKO R I.Spectrophoto metric quantitative determination of water-soluble vitamins in drug mixtures[J].Farm Zh,1976,31(1):68-69.

[2]李全霞,崔亚娟,赵寅菲,等.微生物法测定食品中水溶性维生素的原理及进展[J].食品科学,2013,34(13):338-344.

[3]施卉,邱利焱,金一,等.高效毛细管电泳法测定注射用水溶性维生素的含量[J].中国药学杂志,2007,42(19):1501-1504.

[4]王浩,刘艳琴,杨红梅,等.HPLC法同时测定婴幼儿配方奶粉中5种水溶性维生素[J].中国乳品工业,2009,37(10):56-58.

表4 检测结果 μg/100g

[5]周围,刘倩倩,王波,等.高效液相色谱法同时测定婴幼儿乳粉中7种水溶性维生素[J].分析试验室,2015,(01):49-52.

[6]CHEN P,WOLF W R.LC/UV/MS-MRM for the simultaneous de⁃termination of water-soluble vitamins in multi-vitamin dietary supple⁃ments[J].Analyticaland BioanalyticalChemistry,2007,387(7):2441-2448.

[7]陈美君,王旻,亢美娟,等.超高压液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中11种B族维生素[J].食品科学,2016,37(4):144-153.

Study on simultaneous detection of 12 Water-soluble Vitamins in infant milk powder by HPLC-MS

GENG Jianqiang,ZHAO Li,PAN Hongyan,SHAO Mingyuan,WANG Hao

(Nation Food Quality&Safety Supervision and Inspection Center,Beijing 100094，China)

This thesis developed a method for simultaneous determination of 12 Water-soluble Vitamins in infant milk powder by HPLC-MS.The chromatography was performed using a MGⅢ-C18 column(150 mm × 2.0 mm,5 μm),with a mobile phase consisting of 0.1%formic acid–methanol solution by gradient elution,the flow was 0.25 mL/min,the column temperature was 25℃,and the injection volume was 5 μL.The limits of quantitation were between 0.0001 mg/kg and 1 mg/kg.Overall recoveries of high,medium and low concen⁃trations were between 85.0%and 95.5%,and RSD(n=6)value were between 2.9%and 9.1%.The results showed that the method was sensi⁃tive,accurate,convenient and quick,which can be used to detect simultaneously the 12 water-soluble Vitamins in infant milk powder.

HPLC-MS；infant milk powder；Water-soluble Vitamins

TS252.7

A

1001-2230（2017）08-0043-04

2017-02-17

耿健强（1977-），男，高级工程师，研究方向为食品安全监管。

赵丽