液体培养法在大肠埃希氏菌O157∶H7鞭毛抗原鉴定中的应用研究*

2017-09-28张芳

福建轻纺 2017年5期

关键词：埃希氏玻片菌体

张芳

（福建省产品质量检验研究院国家加工食品监督检验中心(福州)，福建福州 350002）

液体培养法在大肠埃希氏菌O157∶H7鞭毛抗原鉴定中的应用研究*

张芳

（福建省产品质量检验研究院国家加工食品监督检验中心(福州)，福建福州 350002）

优化了一种致泻性大肠埃希氏菌H抗原凝集试验方法。方法将目标可疑菌加至无菌营养肉汤中，通过培养离心收集菌体沉淀，洗涤菌悬液用于待检相H抗原的玻片凝集试验。结果显示，该凝集试验方法效果显著，检测迅速，值得进一步推广和使用。

大肠埃希氏菌O157∶H7；H抗原鉴定；液体培养法

致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌，在我国也居引起感染性腹泻的所有传染病之首。致泻性大肠埃希氏菌国际上分类主要包括5类，即肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和粘附性肠埃希氏菌（EAEC），因此快速准确地检测这5种病原菌对预防和控制由其引起食物中毒事件有着十分重要的作用[1]。肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌，以O157:H7血清型为代表菌株。为了提高大肠埃希氏菌O157:H7检测技术水平，对于H血清凝集试验的试验优化就尤为重要。

大肠埃希氏菌O157:H7的血清诊断中，鞭毛抗原的血清分型是不可缺少的重要步骤，但是大肠埃希氏菌O157:H7的鞭毛结构不稳定，加热、乙醇处理、干燥、冷冻等这些因素都可使其鞭毛生长困难[3，4]，从而对H抗原的鉴定带来不利影响。传统的大肠埃希氏菌O157:H7的鞭毛抗原鉴定方法一般将目标菌株划线于营养琼脂，然后将培养物用于血清凝集试验。若待测抗原与血清均无明显凝集时，需在半固体中诱导多次，再进行凝集试验。该传统方法凝集速度慢、干扰大、操作繁琐。针对上述缺点，文章引入液体培养法进行大肠埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原的鉴定，以期探寻一种操作简便、干扰小、重复性好的H抗原鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠埃希氏菌O157:H7 菌株（NCTC12900）购自北京国家典型培养物保藏中心；大肠埃希氏菌O157和H7血清诊断盒购自宁波天润生物药业有限公司；营养肉汤、半固体琼脂、营养琼脂购自北京陆桥技术有限公司。

1.2 传统H抗原鉴定方法[2]

将大肠埃希氏菌O157:H7（NCTC12900）菌株活化后划线接种于营养琼脂，36±1℃培养18～24h，取培养物1环接种物做玻片凝集或试管凝集试验。若待测抗原与血清均无明显凝集，应首先从营养琼脂上挑取培养物，再进行半固体管穿刺培养，36±1℃培养18～24h，重复半固体培养2～3次后再进行血清凝集试验。

1.3 优化试验方法（液体培养法）

1.3.1 将大肠埃希氏菌O157:H7（NCTC12900）菌株活化后接种于无菌营养肉汤于36±1℃培养18h获得培养物。

1.3.2 将培养物转移至无菌离心管内，于5000 r/min条件下离心10min，移弃上清液，保留离心管底部的菌体沉淀。

1.3.3 向含有菌体沉淀的离心管内添加无菌生理盐水（无菌生理盐水与培养物的体积之比为1:1），用移液器轻轻吸吹，直至菌体完全悬浮，再次于5000 r/min下离心10 min，移弃上清液，完成洗液步骤。

1.3.4 向完成细菌步骤的离心管内添加无菌生理盐水（菌体沉淀与无菌生理盐水的体积比为1:2），用移液器轻轻吸吹混匀，得到菌悬液。1.3.5 取10uL待检相H因子血清滴加于干净玻片上，取1uL菌悬液添加至血清液滴中，混匀并倾斜摇动玻片，1 min之内观察凝集现象，同时在玻片另一区域用无菌生理盐水代替待检H因子血清，与菌悬液混匀后作为对照。

2 结果与讨论

传统H抗原鉴定方法和液体培养法进行大肠埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原鉴定的结果比较如下：

表1 血清凝集鉴定结果

表1显示采用液体培养法进行大肠埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原鉴定的凝集速度快，在10s内即可凝集，操作过程中瞬间即可观察到凝集颗粒，而传统方法需要30～60s的时间才出现明显的凝集颗粒。在反应速度方面，液体培养法明显优于传统方法。此外，传统方法存在琼脂干扰，琼脂颗粒与凝集颗粒难以分辨。而液体培养法通过沉淀、洗涤，获得菌悬液，消除了琼脂颗粒对凝集试验现象的干扰。同时，每个方法进行了多次玻片凝集试验，液体培养法的凝集效果均稳定，重复性好。

血清分型是鉴别各类大肠埃希氏菌的重要方法之一，为了更好的诊断大肠埃希氏菌O157:H7 的鞭毛抗原，可以将菌株接种到液体培养基中，促使其鞭毛更好的发育，再通过离心收集菌体沉淀，获得的菌悬液用于大肠埃希氏菌O157:H7 鞭毛抗原的凝集试验。试验证明该方法凝集速度快、现象明显、干扰小、重复性好、成功率高、操作简便。

对于H血清凝集试验通常采用半固体琼脂作为菌株生长的底物，琼脂的存在抑制培养基的流动性，这与鞭毛的运动特性存在拮抗作用，从而阻碍H抗原性的复原。此外，致泻性大肠埃希氏菌O157:H7可突破低浓度琼脂，扩散至培养基内部长，造成菌体挑取困难，因此在进行H抗原的玻片凝集试验时，培养基不可避免的随菌体进入血清液滴中，且无法完全分散，微小的固态培养基颗粒极易与血清凝集颗粒混淆，从而严重干扰凝集结果的判定。另外，H抗原的凝集物为絮状，不易观察，实验中往往需要挑取较多的菌体以增强凝集效果，这与降低固态培养基干扰的目的互相矛盾。

因此液体培养法可以克服传统方法进行致泻性大肠埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原试验时存在的干扰大、成功率低、操作复杂、费时多等缺点，可以快速高效、简便快捷的得到稳定可靠的H抗原鉴定结果。